ЭлБиб

ХРАНЕНИЕ И ПЕРЕРАБОТКА СЕЛЬХОЗСЫРЬЯ, № 2, 2012

Ïîñëå îòáîðà òðàíñôîðìàíòîâ ïî ïîâûøåííîìó

óðîâíþ ýêñïðåññèè ýíäîèíóëèíàçû áûëî ïðîâåäå-

íî ãëóáèííîå êóëüòèâèðîâàíèå èñõîäíîãî øòàììà

P. canescens

(niaD

) è øòàììîâ-ïðîäóöåíòîâ ýíäî-

èíóëèíàçû, êîòîðîå ïðîâîäèëè â òå÷åíèå 5 ñóò ïðè

30 °Ñ ñ ïåðåìåøèâàíèåì 250 ìèí

-1

íà ñðåäå, ñîäåð-

æàùåé (ã/ë): ñîåâóþ øåëóõó — 4,5; êóêóðóçíûé ýêñ-

òðàêò — 5; ÊÍ

ÐÎ

— 2,5. Àêòèâíîñòü ïî èíóëèíó

òîïèíàìáóðà ñàìîãî àêòèâíîãî øòàììà-ïðîäóöåíòà

ýíäîèíóëèíàçû ñîñòàâèëà 100 åä/ìë.

Ôåðìåíòíûé ïðåïàðàò ýíäîèíóëèíàçû INUA-A3,

ïðåäñòàâëÿâøèé ñîáîé ëèîôèëüíî âûñóøåííóþ

êóëüòóðàëüíóþ æèäêîñòü íàèáîëåå àêòèâíîãî ñ òî÷-

êè çðåíèÿ ïðîäóêòèâíîãî ýíäîèíóëèíàçû òðàíñôîð-

ìàíòà, èñïîëüçîâàëè äëÿ èññëåäîâàíèÿ åãî ñâîéñòâ è

ãèäðîëèòè÷åñêîé ñïîñîáíîñòè ïðè îñàõàðèâàíèè

êëóáíåé òîïèíàìáóðà.

Ñîäåðæàíèå áåëêà è óäåëüíàÿ àêòèâíîñòü ÔÏ ïî

îòíîøåíèþ ê ðàçëè÷íûì ñóáñòðàòàì ïðåäñòàâëåíû

â òàáë. 1.

Àêòèâíîñòü ÔÏ INUA-A3 ïî îòíîøåíèþ ê èíó-

ëèíó áûëà ïðèìåðíî â 600–800 ðàç âûøå, ïî îòíî-

øåíèþ ê ñàõàðîçå — ïðèìåðíî â 2 ðàçà âûøå, ïî îò-

íîøåíèþ ê êñèëàíó — ïðèìåðíî â 3 ðàçà íèæå ïî

ñðàâíåíèþ ñ ñîîòâåòñòâóþùèìè àêòèâíîñòÿìè êîí-

òðîëüíîãî ÔÏ RN3-11-7, ïîëó÷åííîãî ñ ïîìîùüþ

ðåöèïèåíòíîãî øòàììà

P. canescens

(niaD

Ñîäåðæàíèå áåëêà â ÔÏ îïðåäåëÿëè ìåòîäîì Ëî-

óðè [8], èíóëèíàçíóþ, ñàõàðàçíóþ è êñèëàíàçíóþ

àêòèâíîñòè — ïî íà÷àëüíûì ñêîðîñòÿì îáðàçîâàíèÿ

âîññòàíàâëèâàþùèõ ñàõàðîâ (ÂÑ) ïðè ãèäðîëèçå

èíóëèíà òîïèíàìáóðà è öèêîðèÿ («ÐÅÀÕÈÌ»), ñà-

õàðîçû («Merck») è êñèëàíà («Sigma») ñîîòâåòñòâåí-

íî (ñîãëàñíî ìåòîäèêå [9]).

Ãèäðîëèòè÷åñêóþ (îñàõàðèâàþùóþ) ñïîñîáíîñòü

ÔÏ îïðåäåëÿëè ïî âûõîäó ÂÑ è ãëþêîçû [10] â òå÷å-

íèå 3–24 ÷ ãèäðîëèçà èçìåëü÷åííûõ êëóáíåé òîïè-

íàìáóðà (èçìåëü÷åíèå ïðîâîäèëîñü íà ïèùåâîé òåð-

êå) ïðè ðàçëè÷íûõ äîçèðîâêàõ ÔÏ (ìã áåëêà íà 1 ã

ÑÂ ñóáñòðàòà): 0,05; 0,1; 0,5; 2,0 è 5,0 ìã/ã. Ãèäðîëèç

êëóáíåé ïðîâîäèëè ïðè 50 °Ñ è ðÍ 5,0 ïðè ïåðåìå-

øèâàíèè â ðåàêöèîííûõ ÿ÷åéêàõ îáúåìîì 20 ìë.

Ñîñòàâ îáðàçîâàâøèõñÿ ñàõàðîâ (ôðóêòîçû, èíó-

ëîòåðòàîçû è èíóëîïåíòàîçû) èçó÷àëè ñ èñïîëüçî-

âàíèåì õðîìàòîãðàôè÷åñêîé ñèñòåìû «Agilent 1100»

(Agilent, ÑØÀ) ñ êîëîíêîé CarboPac PA-20 (Dionex,

ÑØÀ), äåòåêòèðîâàíèå ïðîâîäèëè â ðåæèìå ïóëü-

ñèðóþùåé àìïåðîìåòðèè [11].

Íà ðèñ. 2 ïðåäñòàâëåíû ðåçóëüòàòû ôåðìåíòàòèâ-

íîãî ãèäðîëèçà êëóáíåé òîïèíàìáóðà ÷åðåç 3 ÷, íà

ðèñ. 3 — ÷åðåç 24 ÷.

ÔÏ RN3-11-7, ïîëó÷åííûé ñ ïîìîùüþ ðåöè-

ïèåíòíîãî øòàììà

P. canescens

(niaD

), ïðè ìàêñè-

ìàëüíîé äîçèðîâêå 5 ìã/ã ñóáñòðàòà ÷åðåç 3 ÷ ãèäðî-

ëèçà ïðè èñõîäíîé êîíöåíòðàöèè ñóáñòðàòà 100 ã/ë

ñóáñòðàòà (íà ÑÂ) ïðèâîäèë ê îáðàçîâàíèþ 18,8 ã/ë

ÂÑ, êîòîðûå áûëè ïðåäñòàâëåíû â îñíîâíîì ôðóê-

òîçîé (8,5 ã/ë) è ãëþêîçîé (2,7 ã/ë). ×åðåç 24 ÷ âû-

õîä càõàðîâ ñîñòàâëÿë 25,5 ã/ë ÂÑ, 22,5 ã/ë ôðóê-

òîçû è 3 ã/ë ãëþêîçû. Íàëè÷èå îïðåäåëåííîé ãèä-

ðîëèòè÷åñêîé ñïîñîáíîñòè ó ÔÏ RN3-11-7 îáóñëîâ-

ëåíî òåì, ÷òî îí îáëàäàåò çàìåòíîé ñàõàðàçíîé àê-

Nod

I (5518)

Xba

I (5511)

EcoR

I (5494)

Hin

dIII (5482)

Bgl

II (5482)

Nde

l (3306)

Nde

l (2096)

Bam

Hl (2663)

BamHl

(2039)

d (2467)

Bam

Hl(2413)

pPrXYLA-INUA

8392 bp

ORI

APr

inuA A.niger

xylA promoter

LIC3

LIC5

eglIII terminator

Ðèñ. 1. Ñõåìà ýêñïðåññèîííîé ïëàçìèäû pPrXYLA-INUA_Asp. nig

äëÿ òðàíñôîðìàöèè ðåöèïèåíòíîãî øòàììà P. canescens

(niaD

) RN3-11-7

INUA-A3 237 11,6

7,91 23,9 11,8

RN3-11-7 336

0,02

0,01 11,3 38,1

* В м / .

Таблица 1

Удельная а тивность ферментных препаратов

по отношению различным с бстратам,

ед/м бел а

Бело *

Препарат

Ин!лин

топинам-

б!ра

Ин!лин

ци ория

Саха-

роза

Ксилан

Выход прод! та, /л

S RN3 –

5 м

INUA –

0,05 м

INUA –

0,1 м

INUA –

0,5 м

INUA –

2 м

INUA –

5 м

Ðèñ. 2. Âûõîä càõàðîâ ïðè ãèäðîëèçå êëóáíåé òîïèíàìáóðà ÷

ïðåïàðàòîì ýíäîèíóëèíàçû INUA-A3 ÷åðåç 3 (óñëîâèÿ:

50 °Ñ, ðÍ 5, [S] = 100 ã/ë (ÑÂ), ïåðåìåøèâàíèå – 250 ìèí

-1

1 – ãëþêîçà; 2 – ôðóêòîçà; 3 – ÂÑ

Выход прод! та, /л

S RN3 –

5 м

INUA –

0,05 м

INUA –

0,1 м

INUA –

0,5 м

INUA –

2 м

INUA –

5 м

Ðèñ. 3. Âûõîä càõàðîâ ïðè ãèäðîëèçå êëóáíåé òîïèíàìáóðà

ïðåïàðàòîì ýíäîèíóëèíàçû INUA-A3 ÷åðåç 24 ÷ (óñëîâèÿ:

50 °Ñ, ðÍ 5, [S] = 100 ã/ë (ÑÂ), ïåðåìåøèâàíèå – 250 ìèí

-1

1 – ãëþêîçà; 2 – ôðóêòîçà; 3 – ÂÑ

Электронная Научная СельскоХозяйственная Библиотека