ЭлБиб

61 / 116

59
ПИЩЕВАЯ ПРОМЫШЛЕННОСТЬ 12/2010
FOOD PROVISION SECURITY
QUALITY AND SAFETY FOODSTAFFS
ся изменением их консистенции и
появлением неспецифических запа
хов [13].
В связи с этим, для выделения
суммарной ДНК были использованы
жабры, соскобы с внешних покро
вов, слизь с внутренней полости и
почки байкальского омуля. Фраг
менты органов и тканей рыб отбира
ли в стерильных условиях, материал
сразу же обрабатывали лизирующи
ми буферами. Выделение суммар
ной ДНК проводили, используя ком
мерческие наборы «РИБО сорб»,
«ДНК сорб А» и «ДНК сорб Б» («Ам
плиСенс», Москва) по прилагаемой
инструкции с небольшими модифи
кациями. Пробы прогревали 5–10
мин при 60 °С, центрифугировали 15
мин при 12000 мин–1, надосадочную
жидкость переносили в новую про
бирку. К прозрачному лизату добав
ляли 25 мкл сорбента, тщательно пе
ремешивали, выдерживали при
комнатной температуре 5 мин, пери
одически взбалтывая. Дальнейшую
обработку вели, как рекомендовано
в инструкциях фирмы производите
ля. Нуклеиновые кислоты элюирова
ли в 25 мкл ТЕ буфера: осадок тща
тельно суспендировали, прогревали
в термостате 5 мин при 60°С и цент
рифугировали 5 мин при 12000 мин–1.
Надосадочную жидкость тщательно
отбирали в новую пробирку и ис
пользовали в качестве матрицы в
полимеразной цепной реакции
(ПЦР).
В работе использовали праймеры,
комплементарные наиболее консер
вативным участкам гена 16S рРНК
бактерий (в скобках дана нумерация
нуклеотидов по Escherichia coliили
по соответствующему типовому
штамму) 500L (514–533) и 1350R
(1389–1407), групп специфичные
для филогенетической линии Firmi
cutes BLS (342 360) и видоспеци
фичные праймеры на Acinetobacter
calcoaceticus(652 669), Pseudo
monas aeruginosa(178 193 и 600
617), Aeromonas hydrophyla(424 451
и 1090 1111) и Bacillussp. (275 294 и
1370 1388) («БиоСан», Новосибирск)
[14]. В амплификации подбирали ре
жим, обеспечивающий высокое ка
чество ПЦР продукта нужной длины.
Для этого ПЦР проводили в разных
условиях, в том числе проверяя тем
пературу отжига в градиенте темпе
ратур от 44 до 72°С в амплификаторе
DNA Engine DYADTM. Анализ продук
тов амплификации проводили фрак
ционированием смесей в 1,5 % ном
агарозном геле с бромистым этиди
ем. Результаты анализа визуализи
ровали на трансиллюминаторе в УФ
свете.
Для оценки микробиологической
безопасности мороженого и солено
го омуля с применением ПЦР на пер
вом этапе исследования использова
ны пары консервативных праймеров
на все бактерии и филогенетическую
группу грамположительных споро
образующих бактерий. Внешние по
кровы рыб значительно обсеменены
микроорганизмами, в отличие от
жабр и внутренней полости (рис. 1).
Наличие ПЦР продуктов бактери
ального происхождения свидетель
ствует об эффективности примене
ния молекулярно генетического ана
лиза и в дальнейшем служит поло
жительным контролем.
На следующем этапе были выбра
ны праймеры, специфичные на оп
ределенные виды микроорганизмов,
вызывающие порчу рыбной продук
ции – P. aeruginosa, A. hydrophylaи
Bacillussp., а также широко распрос
траненные в окружающей среде (A.
calcoaceticus) [15]. Во всех проанали
зированных образцах детектируется
специфичный ампликон для A.
calcoaceticus, что служит очевидным
показателем распространения этого
вида бактерий (рис. 2). Развитие
других видов микроорганизмов A.
hydrophyla и P. aeruginosaсвязано с
заболеваниями рыб в естественных
местах обитания. Положительный
продукт детектируется во всех об
разцах, полученных из соленого
омуля, что может свидетельствовать
о развитии и размножении этого
вида микроорганизма при консерви
ровании и хранении рыбной продук
ции. В образцах мороженого омуля
положительный ампликон детекти
руется только на внутренней полости
рыбы, что подтверждает преимуще
ства быстрой и глубокой заморозки
рыбной продукции для сохранения
качества рыбы. Известно, что грам
положительные спорообразующие
бактерии Bacillus sp. имеют более
высокий потенциал для сохранения
в виде спор и последующего раз
множения. Полное отсутствие поло
жительного продукта для этого вида
микроорганизмов может свидетель
ствовать о безопасности проанали
зированных образцов омуля.
Промышленная стерильность рыб
ной продукции означает отсутствие в
ней микроорганизмов, способных
развиваться при температурах хра
нения, установленных для данного
вида продуктов, и отсутствие микро
организмов, опасных для здоровья
потребителя [16].
Для бактериологического исследо
вания используют традиционный
(классический) микробиологичес
кий подход, который предполагает
культивирование на селективных
средах отдельных физиологических
групп органотрофных бактерий. Эта
методология имеет два существен
ных ограничения: во первых, ре
зультаты, получаемые после культи
вирования, очень трудно оценить и
перевести в количественные харак
теристики микробного разнообра
зия. Подсчет числа колоний, вырос
ших на питательных средах, недо
учитывает общую численность мик
роорганизмов, а одновременное ис
пользование различных селективных
сред приводит к переоценке резуль
тата. Ошибка метода культивирова
ния может достигать 50 % [17]. При
этом отдельные группы культивиру
емых микроорганизмов оказываются
неучтенными.
Рис. 2. Результаты электрофоретического анализа
обсемененности мороженного (JF1 3) и соленого (JF10
12, 19 21) байкальского омуля на видо специфичных
парах праймеров на A. calcoaceticus, P. aeruginosa, A.
hydrophyla и Bacillus sp: cтрелками обозначены позиции
специфичных ПЦР продуктов; М – маркер
молекулярной массы; цифрами обозначен размер
фрагментов ДНК в парах нуклеотидов (п.н.)
1000 п.н.
500 п.н.
1000 п.н.
500 п.н.
Рис. 1. Результаты электрофоретического анализа
обсемененности мороженного (JF1 3) и соленого (JF10
12, 19 21) байкальского омуля на групп специфичных
парах праймеров на Bacteria и Firmicutes: cтрелками
обозначены позиции специфичных ПЦР продуктов; М –
маркер молекулярной массы; цифрами обозначен
размер фрагментов ДНК в парах нуклеотидов (п.н.); JF1,
JF10, JF19 – соскоб с внешних покровов рыб; JF2, JF11,
JF20 – жабры со слизью; JF3, JF12, JF21 – слизь с
внутренней полости и почки
1000 п.н.
500 п.н.
Электронная Научная СельскоХозяйственная Библиотека