ЭлБиб

2016 |

№2

ТЕОРИЯ И ПРАКТИКА ПЕРЕРАБОТКИМЯСА

ture or enzyme), autolysis or direct hydrolysis [5, 8–10].

However, a question of expediency of directed proteoly-

sis against tissue-specific proteins already possessing bio-

logical function and selectively cleaved by gastrointestinal

tract enzymes is ambiguous.

Previously, we have studied aortas and cardiac muscles

Bos taurus

and

Sus scrofa

and showed the presence of tis-

sue-specific biologically active substances with molecular

weight in the range of 10 to 100 kDa, which were involved

in lipid metabolism, antioxidant protection and function-

ing of vascular endothelial layer [2, 3].

The purpose of this study was to evaluate the effect of

autolytic processes on the preservation of target protein

molecules contained in heart and aorta of farm animals

(

Bos taurus

and

Sus scrofa

Materials and methods

Objects of the study were

Bos taurus

and

Sus scrofa

car-

diac muscle and aorta tissues frozen at minus 10 °C or sub-

jected to autolysis at 2 ± 2 °C for 4 days.

One-dimensional electrophoresis was performed ac-

cording to the method of Laemmli [7] in 7.5–25% poly-

acrylamide gel with the presence of SDS. The marker

was used comprising of eleven standards with molecular

weight of 170, 130, 95, 72, 55, 43, 34, 26, 17, and 10 kDa

(Fermentas, USA).

Two-dimensional electrophoresis was performed ac-

cording to the method of O’Farrell [11] with isoelectric fo-

cusing in ampholine pH gradient (IEF-PAGE). The subse-

quent detection of the proteins was carried out by staining

with silver nitrate as described previously [1, 6].

Identification of protein fractions was performed on DE

after trypsinolysis by MALDI-TOF/MS and MS/MS mass

spectrometry on Ultraflex MALDI-TOF mass spectrome-

ter (Bruker, Germany) with UV laser (336 nm) in the posi-

tive ion mode in molecular weight range of 500–8000 Dа

with calibration according to known peaks of trypsin au-

tolysis. Analysis of obtained tryptic peptides mass spectra

was performed using Peptide Fingerprint option in Mascot

software (Matrix Science, USA) with MH+ mass determi-

nation accuracy of 0.01%; search was performed in data-

bases of the National Center for Biotechnology Informa-

tion, USA (NCBI).

Results and discussion

The comparative proteomic analysis of frozen and au-

tolyzed tissue samples of

Bos taurus

and

Sus scrofa

cardiac

muscle and aorta showed that the most intense bands on

the electrophoregram were observed in the range from

100 to 10 kDa. However, samples subjected to autolysis re-

vealed an increase in the diversity and intensity of factions

especially in autolyzed cardiac muscle (

Figure 1

Для накопления в мясном сырье функциональных пеп-

тидов используют различные методы, в том числе вклю-

чающие ферментацию (с использованием стартовой

культуры или фермента), автолиза или прямого гидро-

лиза [5, 8–10]. Однако неоднозначно стоит вопрос целе-

сообразности направленного протеолиза в отношении

тканеспецифичных белков уже несущих биологическую

функцию и способных избирательно расщепляться

ферментами желудочно-кишечного тракта.

Ранее авторами были проведены исследования сер-

дец и аорт

Bos taurus

Sus scrofa

, которые показали

наличие в них тканеспецифичных биологически ак-

тивных веществ с молекулярной массой в диапазоне

от 100 до 10 кДа, вовлеченных в липидный обмен, ан-

тиоксидантную защиту и функционирование эндоте-

лиального слоя сосудов [2, 3].

Целью данного исследования являлось изучение

влияния автолитических процессов на сохранность

целевых белковых молекул, содержащихся в сердеч-

ной мышце и аорте сельскохозяйственных животных

(свиней и КРС).

Материалы и методы

Объектами исследования являлись ткани сердеч-

ной мышцы и аорты

Bos taurus

Sus scrofa

, заморожен-

ные при минус 10°С или подвергнутые автолизу при

2±2 °С в течение 4 суток.

Одномерный электрофорез проводился по методу

Лэммли [7] с градиентом ПААГ 7,5–25% в присутст-

вии SDS. В качестве свидетелей использовали маркер,

включающий одиннадцать стандартов с молекуляр-

ной массой 170, 130, 95, 72, 55, 43, 34, 26, 17 и 10 кДа

(Fermentas, США).

Двумерный электрофорез (ДЭ) проводился по ме-

тоду О’Фаррелла [11] с изоэлектрофокусированием

в амфолиновом (IEF-PAGE) градиенте pH; последую-

щую детекцию белков проводили окрашиванием азот-

нокислым серебром, как описано ранее [1, 6].

Идентификацию белковых фракций на ДЭ осу-

ществляли после трипсинолиза методами MALDI-TOF

MS и MS/MS масс-спектрометрии на MALDI- время-

пролетном масс-спектрометре Ultraflex («Bruker», Гер-

мания) с УФ-лазером (336 нм) в режиме положитель-

ных ионов в диапазоне масс 500–8000 Да с калибровкой

их по известным пикам автолиза трипсина. Анализ

полученных масс-спектров триптических пептидов вы-

полняли с помощью программы Mascot, опция Peptide

Fingerprint («Matrix Science», США), с точностью опре-

деления массы МН+ равной 0.01%, осуществляя поиск

по базам данных Национального центра биотехнологи-

ческой информации США (NCBI).

Результаты и их обсуждение

Проведенный сравнительный протеомный анализ

замороженных и автолизированных образцов тканей

сердец и аорт

Bos taurus

Sus scrofa

показал, что наибо-

лее интенсивное представление полос на электрофо-

реграмме было отмечено в диапазоне от 100 до 10 кДа.

Однако в сырье, подвернутом автолизу, выявлено уве-

личение разнообразия и интенсивности фракций осо-

бенно у автолизированной сердечной мышцы (

Рис. 1

Электронная Научн я СельскоХозяйственная Библиотека