ЭлБиб

•

2010

ПИВО

НАПИТКИ

ТЕХНОЛОГИЯ

образуется сумка (аск) с четырьмя

гаплоидными спорами, содержащими

в своих ядрах редуцированный поло-

винный набор хромосом (

). В норме

в аске дрожжей рода

Saccharomyces

должно быть две споры типа спари-

вания «а» и две — «

». Две споры

противоположного типа спаривания

могут копулировать, образуя зиготу

с восстановленным двойным набором

хромосом, от которой отпочковывают-

ся вегетативные клетки.

Для осуществления скрещивания

из аска необходимо выделить отдель-

ные споры и наблюдать их копуляцию

со спорой противоположного знака.

Эти операции осуществляют с помо-

щью микроманипулятора под контро-

лем микроскопа. Во влажной камере

из капли со спорулирующей культурой

микроиглой вытаскивают аск со спора-

ми, разрывают оболочку аска, и споры

растаскивают в отдельные мелкие кап-

ли с питательной средой. Чтобы легче

было разрушить оболочку аска, спо-

рулирующую культуру обрабатывают

1%-ным водным раствором целлюлазы

или желудочным соком виноградной

улитки. Через 15–30 мин оболочка

аска разрывается, а через 35–40 мин

споры расходятся.

Если изолировать одну спору, она

дает начало гаплоидной культуре

дрожжей. Гаплоидные клетки дрож-

жей обычно мельче по размерам

по сравнению с диплоидной культурой

и форма их более округлая. Гаплоид-

ные клетки не расходятся, а образуют

скопления в виде грозди из несколь-

ких клеток. Моноспоровая культура

имеет определенный половой знак

«а» или «

» и при совместном выра-

щивании с культурой противополож-

ного типа может произойти слияние

клеток и восстановление нормальной

вегетативной фазы с двойным набо-

ром хромосом. Таким образом, имеет-

ся возможность получать новые расы

дрожжей рода

Saccharomyces

мето-

дом гибридизации, скрещивая между

собой отдельные споры или гаплоид-

ные вегетативные клетки.

Преимуществаметода гибридизации

основаны на том, что половой процесс

увеличивает генетическое разнообра-

зие в экспериментальных популяциях

дрожжей, вследствие чего можно бо-

лее эффективно проводить селекцию

дрожжей. Кроме того, гибридизация

позволяет снизить мутационный груз

в популяции дрожжей [2]. Было пока-

зано, что мутации постоянно накапли-

ваются в популяции диплоидов при

неизменных внешних условиях, при

этом множество опасных и летальных

мутаций не ухудшает положение более

чемна 10%, иразмерпопуляцийумень-

шается. В отличие от этого популяции

гаплоидов подвержены более высокой

смертности, их плотность снижается

на несколько порядков. Эти данные

свидетельствуют о неэффективности

природной селекции, не удаляющей

опасные мутации из популяции дипло-

идов, в которых постоянно возрастает

генетическая дегенерация. Таким об-

разом, получение жизнеспособных га-

плоидов и их дальнейшее скрещивание

помогают избавиться от накопившихся

мутаций.

Пивные дрожжи в диком виде в при-

роде не встречаются, их происхожде-

ние неизвестно и среда обитания —

только пивоварение. Пивные дрожжи

низового брожения существуют в те-

чение многих веков только в вегета-

тивной стадии и размножаются в про-

изводстве почкованием. Так как эти

дрожжи сохраняются постоянно в ак-

тивном состоянии, они в значительной

степени утратили способность к спо-

рообразованию, т.е. те фазы развития,

которые связаны с необходимостью

сохранять свою жизнеспособность

при возникновении неблагоприятных

условий и истощении источников пи-

тания. Отсюда возникают трудности

в работе по выведению новых штам-

мов пивных дрожжей. Однако в лабо-

ратории на специально подобранных

средах удается наблюдать появление

асков со спорами.

Чтобы получить у пивных дрожжей

низовогоброжения спорыв количестве,

достаточном для проведения селекци-

онных работ, необходимо подобрать

условия культивирования дрожжей,

усиливающие спорообразование. Наи-

лучшие результаты получаются, когда

дрожжи предварительно выращивают

на богатой питательной среде, затем

дрожжевой осадок отмывают водой

от остатков среды и переносят на спе-

циально подобранную среду, обеднен-

ную питательными веществами.

При подборе обогащенных пита-

тельными веществами предспоровых

сред сравнивали две синтетические

среды и три среды на основе белков

растительного происхождения. Наи-

более успешные результаты были по-

лучены при использовании в качестве

предспоровых томатной среды или не-

охмеленного 11%-ного сусла.

Субстратом для спорообразования

в работах некоторых исследователей

служили гипсовые блоки. В наших ис-

следованиях они не дали положитель-

ных результатов. Более приемлемой

оказалась агаризованная ацетатная

среда, содержащая уксуснокислый

калий с добавлением дрожжевого

автолизата и небольшого количества

глюкозы (0,1%). Высокое содержание

глюкозы в среде (более 2%) угнетало

споруляцию, совсем без глюкозы спор

было на 20–50%меньше, чем при ис-

пользовании низкого содержания это-

го сахара.

Не у всех рас пивных дрожжей уда-

ется получить споры, но у некоторых

можно наблюдать аски со спорами

в количестве от 5 до 20% к общему

числу клеток.

Теоретически, соединяя в одной

капле две споры разных рас, можно

получить зиготу, которая даст нача-

ло вегетативной гибридной культуре.

Эти требования легко осуществимы

для некоторых дрожжей-сахаромице-

тов, но они исключительно трудновы-

полнимы для пивных дрожжей, у кото-

рых слияние спор происходит крайне

редко: из 44 пар спор образование зи-

гот не удалось наблюдать ни в одном

случае.

Тот факт, что в асках пивных дрож-

жей, как правило, содержится не четы-

ре споры, а только одна, две или три,

неизбежно приводит к мысли о том,

что споры пивных дрожжей имеют

несбалансированный набор хромо-

сом, и это служит причиной нежизне-

способности части спор. Среди обра-

зовавшихся спор обычно прорастает

лишь небольшая часть: одна из ста

спор. Изучение плоидности пивных

дрожжей по размеру клеток показало,

что клетки пивных дрожжей являют-

ся полиплоидами и при редукционном

делении образующиеся споры имеют

гаплоидный, диплоидный или анэупло-

идный набор хромосом [3]. При этом

в ряде случаев нежизнеспособными

оказываются сегреганты только одно-

го типа спаривания [4]. Существует

предположение, что пивные дрожжи

S. carlsbergensi

s представляют собой

частичный аллотетраплоид и являют-

ся межвидовым гибридом

S. cerevisia

S. bayanus

, что влияет на снижение

способности у этих дрожжей к полово-

му размножению [5].

Трудоемкость и малая эффектив-

ность изоляции сегрегантных моно-

споровых культур пивных дрожжей

с помощью микроманипулятора за-

ставили искать пути, позволяющие

облегчить эту работу.

Электронная Научная СельскоХозяйственная Библиотека