ЭлБиб

46 / 52

ТЕХНОЛОГИИ ЗАГОТОВКИ, ХРАНЕНИЯ И ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КОРМОВ 44
ͪКормопроизводствоͫ № 7, 2014
новных сельскохозяйственных культур с помощью
метода ПЦР-РВ.
В связи с поставленной целью в задачи исследо-
вания входило сделать выборку основных концен-
трированных кормов, используемых в хозяйствах
Московской области. Далее требовалось устано-
вить с помощью метода количественной ПЦР-РВ
степень заражённости продуцентами микотокси-
нов образцов концентрированных кормов и про-
демонстрировать возможность и эффективность
применения подхода, основанного на методе ПЦР,
для рутинной диагностики заражённости концен-
трированных кормов возбудителями фузариоза.
Методика исследований. Для проведения ана-
лиза нами были получены 14 образцов, которые
представлены в таблице 1.
Образцы № 1–5 закуплены на разных предпри-
ятиях комбикормовой промышленности Москов-
ской области, срок хранения на момент отбора
проб не превышал 1–1,5 мес.
Образцы№ 6–14 получены из коллекции испыта-
тельного центра Московской области.
Выделение ДНК. Для выделения ДНК исполь-
зовали протокол, рекомендованный Европейской
комиссией для количественной оценки содержа-
ния ГМО в образцах зерна (Delobel, 2007). Для на-
стоящей работы протокол был незначительно опти-
мизирован.
К 2 г предварительно измельчённого зерна до-
бавляли 3 мл прогретого лизирующего буфера на
основе цетилтриметиламмонойбродмида (ЦТАБ)
(Murray, 1980) (1 М Трис-НСl, рН — 7,5; 5 М NaCl;
0,5 М ЕDTA, pH — 8,0; 2% ЦТАБ; 1% меркаптоэта-
нол) и 10 мкл протеиназы К (20 мг/мл). Полученную
суспензию инкубировали 1 час при 65ºС, периоди-
чески перемешивая. После инкубации центрифуги-
ровали при 5000 об/мин в течение 20 мин; надоса-
дочную жидкость переносили в чистую пробирку.
К отобранной жидкости добавляли равный объём
(5 мл) хлороформа, центрифугировали 10 мин при
5000 об/мин, переносили верхнюю (водную) фазу в
чистую пробирку, после чего повторяли процедуру.
К отобранной верхней фазе добавляли 2 объёма
преципитирующего буфера (0,04 М NaCl; 5% ЦТАБ)
и инкубировали 1 час при комнатной температу-
ре. Центрифугировали 10 мин при 5000 об/мин.
Удаляли надосадочную жидкость; осадок раство-
ряли в 3,5 мл 1,2 M NaCl, добавляли 5 мкл РНКзы А
(10 мг/мл), инкубировали 30 мин при 37ºС. Затем
добавляли равный объём хлороформа, перемеши-
вали, центрифугировали 20 мин при 5000 об/мин.
Верхнюю фазу переносили в чистую пробирку, до-
бавляли к ней 0,6 объёма изопропанола, инкубиро-
вали 30 мин при комнатной температуре. Центри-
фугировали 20 мин при 5000 об/мин; удаляли супер-
натант. Осадок промывали 2 мл 70% этанола, после
чего растворяли в 100 мкл MilliQ.
Перед внесением в реакционную смесь ДНК,
выделенная из образцов зерна, разбавлялась до
50 нг/мкл.
Проведение ПЦР-РВ. Для проведения ПЦР-РВ
использовали диагностические наборы производ-
ства ООО «АгроДиагностика». Температурный про-
филь ПЦР соответствовал рекомендованному про-
изводителем: 93ºС — 90 с; 93ºС — 20 с, 64ºС — 5 с,
67ºС — 5 с (5 циклов); 93ºС — 1 с, 64ºС — 5 с, 67ºС —
5 с (40 циклов). Состав реакционной смеси был
следующим: 1,8 мкл 10-кратного буфера (750 мМ
Tris-HCl, pH — 8,8; 200 мМ сульфата аммония, 0,1%
Твин-20; 0,5 мМ каждого dNTP, по 6,25 пмоль прай-
меров, 7 пмоль зондов, 1,25 ед. Taq-полимеразы)
и 5 мкл раствора ДНК. Для определения возмож-
ного присутствия ингибиторов полимеразы в ре-
акционную смесь добавлялся также внутренний
контроль (ВК), представляющий собой плазмиду
со вставкой размером 560 п. о., фланкированную
инвертированными последовательностями, гомо-
логичными 1 праймеру, использующемуся для ам-
плификации ВК.
Результаты исследований. Для оценки досто-
верности эксперимента выделение ДНК из каждого
образца проводили в двух повторностях. В целом
концентрация и качество препаратов ДНК были
выше для семян и несколько ниже — для комбикор-
мов. Концентрации ДНК приведены в таблице 2.
Результаты ПЦР-РВ детектировались в процессе
амплификации, отображались в виде графика за-
1. Образцы комбикормов,
зерна и растительного материала,
использованные в работе
№ Образец Дата отбора
1 Комбикорм для овецгранулированный 1 29.04.2013
2 Комбикорм для овецгранулированный 2 01.05.2013
3 Комбикорм для овец рассыпной 29.04.2013
4 Комбикорм для кроликов 29.04.2013
5 Комбикорм для кур 30.04.2013
6 Зерно кукурузы дроблёное 01.05.2013
7 Жмых подсолнечный 01.05.2013
8 Зерно овса 1 01.05.2013
9 Зерно овса 2 01.05.2013
10 Зерно ячменя 01.05.2013
11 Зерно пшеницы 1 01.05.2013
12 Зерно пшеницы 2 01.05.2013
13 Кукуруза 01.05.2013
14 Горох 01.05.2013
Электронная Научная СельскоХозяйственная Библиотека