ЭлБиб

ВОПРОСЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КОРМОВ

ͪКормопроизводствоͫ № 3, 2017

www.kormoproizvodstvo.ru

Методика исследований.

В качестве микроорганизма-

продуцента был выбран штамм

Lactobacillus casei

ВКПМ

В-4990, приобретённый в Национальном биоресурсном

центре «Всероссийская коллекция промышленных микро-

организмов» при ГосНИИгенетика. Согласно паспорту,

штамм

Lactobacillus casei

ВКПМ В-4990 выделен из желудоч-

но-кишечного тракта здорового поросёнка. Он устойчив

к полимиксину, мономицину, неомицину, стрептомицину,

оксициллину, эритромицину. Штамм не является генетиче-

ски модифицированным, относится к микроорганизмам, не-

патогенным для человека, поэтому работа с ним не требует

специальных мер предосторожности. Основные пробиоти-

ческие свойства и оптимальные параметры ферментации

данного штамма на фугате ферментолизата отрубей с моче-

виной были определены ранее (Устюжанинова, 2012б). В ка-

честве инокулята (посевная доза 10%) использовали суточ-

ную культуру лактобактерий III генерации, выращенную на

ферментолизате пшеничных отрубей (ФО+М).

В качестве тест-культур для определения антимикроб-

ной активности полученных синбиотиков использовали

следующие микроорганизмы:

Bacillus cereus

Bacillus subtilis

Escherichia coli M17

Staphylococcus aureus

АТСС 6538-р и

Pseu-

domonas aerugenosa

АТСС 27853 (F51).

В качестве питательного субстрата для основной фер-

ментации использовали ФО+М, который получали по сле-

дующей технологии: гидротермообработка пульпы отрубей

(соотношение по массе отруби:вода — 1:10, температура —

96–100°С, продолжительность 15 мин); охлаждение до 55°С и

корректировка рН до 4,7–5,0 путём добавления концен-

трированной соляной кислоты; ферментативный гидролиз

с ферментными препаратами «Амилосубтилин ГЗХ», «Глюка-

ваморин Г3Х» и «Оптимаш

™

BG» в количестве 1,0 г/кг условно-

го крахмала; 0,8 г/кг условного крахмала и 0,05 г/кг сухих ве-

ществ соответственно при следующих условиях: температу-

ра — 55°С, продолжительность 2 ч, периодическое переме-

шивание; охлаждение, корректировка рН до 7,0–7,2 раство-

ром NaOH и добавление мочевины в количестве 0,02 г/дм

;

стерилизация при 1 ати в течение 40 мин

Характеристика

среды после стерилизации: АСВ — 8,74%; концентрация

питательных веществ в фугате субстрата: аммонийный азот

(в пересчёте на N

) — 0,41 г/дм

, неорганический фосфор

(в пересчёте на P) — 0,66 мг/дм

, редуцирующие вещества

(РВ) — 2,35 г/дм

, редуцирующие вещества после инверсии

(РВИ) — 3,45 г/дм

Для получения культур лактобактерий I и II генерации ис-

пользовали плотную среду лактобакагар (ЛБА) и ПД-бульон

с лактозой (ПДЛ) соответственно. Для количественного

определения жизнеспособных клеток бактерий чашечным

методом Коха и для определения антагонистической актив-

ности методом перпендикулярных штрихов в качестве пита-

тельной среды использовали плотную среду ЛБА.

Бульон ПДЛ имел следующий состав (г/дм

): пептон фер-

ментативный сухой для бактериологических целей — 9,0;

ферментативный гидролизат казеина неглубокой степени

расщепления — 8,0; дрожжевой экстракт — 3,0; хлорид на-

трия — 5,0; натрия гидроортофосфат — 2,0; лактоза — 10,0.

Среда ЛБА имела состав (г/дм

): панкреатический гидроли-

зат рыбной муки сухой с твином — 21,0; экстракт пекар-

ских дрожжей — 5,0; экстракт мясной или пептон сухой

ферментативный — 5,0; D-глюкоза — 20,0; калий фосфор-

нокислый однозамещённый — 2,0; натрий уксуснокислый

3-водный — 5,0; аммоний лимоннокислый однозамещён-

ный — 2,0; магний сернокислый 7-водный — 0,1; марганец

хлористый 4-водный — 0,05; агар — 13,0 ± 2,0.

Ферментацию осуществляли в лабораторном биореак-

торе Biostat

B plus (Sartoris Stedim Systems, GmbH) с резер-

вуаром для культивирования объёмом 2 дм

, содержащим

1,5 дм

питательной среды, при температуре 36–37° С, рН —

7,0, в анаэробных условиях. Все параметры ферментации

поддерживались автоматически. Статирование кислотности

производилось подтитровкой 2 н раствором NaOH. Каждые

4 ч производили отбор проб для определения количества

жизнеспособных клеток лактобактерий.

Концентрирование осуществляли центрифугированием

при 3600 об/мин в течение 10 мин на центрифуге Centra-CL2

(Thermo Electron Corporation) с последующим декантацией.

Сушку проводили при температуре 50–55°С в сухожаро-

вом шкафу (Precision Scientific Thelco Laboratory Oven) в тече-

ние 2–3 ч.

Иммобилизацию осуществляли следующим образом:

биосуспензию лактобактерий тщательно перемешивали

с носителем в соотношении 1:1 по массе АСВ. В качестве но-

сителя использовали активированный уголь.

Количество жизнеспособных клеток бактерий (число

колониеобразующих единиц, КОЕ) в 1 см

бактериальной

суспензии для анализа определяли чашечным методом Коха

(Руководство по практическим занятиям по микробиологии,

1995). Бактериальную суспензию готовили следующим об-

разом: при соблюдении правил асептики отбирали навеску

исследуемого образца массой около 1 г (точную массу за-

писывали с точностью до 0,01 г), добавляли 100 см

стериль-

ного физраствора (0,85% раствора хлорида натрия) и тща-

тельно перемешивали. Концентрацию живых лактобактерий

в исходных образцах рассчитывали с учётом массы навески

и объёма физраствора, взятого для её суспендирования

(100 см

Концентрацию РВ и РВИ в культуральной жидкости опре-

деляли эбулиостатическим методом (Емельянова, 1969).

Инверсию проводили в серной кислоте (1 см

концентри-

рованной кислоты на 50 см

анализируемого раствора) при

кипячении с обратным холодильником в течение 2 ч. Содер-

жание лактата определяли с помощью колориметрического

метода с n-оксидифенилом (Практикум по биохимии, 1989).

Концентрацию неорганического фосфора (в пересчёте на P)

определяли колориметрическим методом (Ляпустин, 1999).

Концентрацию аммонийного азота (в пересчёте на N

) опре-

деляли колориметрическим методом с реактивом Несслера

(Ляпустин, 1999).

Количество абсолютно сухого вещества рассчитывали

по влажности продукта, которую определяли методом вы-

сушивания навески до постоянной массы при 100–105°С

(ГОСТ 13496.3-92). Массовую долю азота (общий азот) опре-

деляли методом Кьельдаля (ГОСТ 13496.4-93). Содержание

сырого протеина рассчитывали по массовой доле азота,

определённой титриметрическим методом Кьельдаля (ГОСТ

13496.4-93). Массовую долю белка определяли методом

Барнштейна (ГОСТ 28178-89). Содержание сырой клетчатки

определяли по массе осадка, нерастворимого в разбавлен-

ной кислоте и щёлочи (ГОСТ 13496.2-91).

Антагонистическую активность определяли методом

перпендикулярных штрихов (Руководство по практическим

занятиям по микробиологии, 1995) на плотной среде ЛБА

Электронная Научная СельскоХозяйственная Библиотека