ЭлБиб

ПИЩЕВАЯПРОМЫШЛЕННОСТЬ

6/2014

PROCESSING OF PLANT RAW MATERIALS

мощью которого в течение несколь-

ких часов можно выделить и размно-

жить определенную последователь-

ность ДНК в количестве, превышаю-

щем исходное в 10

раз. В основе ме-

тода лежит многократное копирова-

ние с помощью фермента ДНК-поли-

меразы определенного фрагмента

ДНК по принципу комплементарнос-

ти, который является маркерным для

данного вида объекта. ПЦР-анализ

состоит из трех основных процедур:

подготовка пробы исследуемого ма-

териала, которая в большинстве слу-

чаев сводится к изоляции ДНК и ее

очистке; амплификация (собственно

ПЦР) и детекция продуктов амплифи-

кации [5].

Популярность ПЦР-анализа кроется

в его преимуществах. К основным до-

стоинствам данного метода анализа

относят: специфичность, универсаль-

ность (могут применяться практичес-

ки любые материалы), высокая чув-

ствительность (возможно выявлять

единичные копии ДНК), малый

объем биологического материала

(проведение анализа возможно в

минимальном объеме пробы, до не-

скольких микролитров); высокая ско-

рость получения результата анализа [6].

Цель настоящего исследования –

анализ влияния технологической об-

работки продовольственного сырья на

эффективность видовой идентифика-

ции с помощью ПЦР-анализа.

В качестве объектов исследования

использовали ДНК пищевых продук-

тов, а именно, повидла (100%-ного),

изготовленного на основе следующих

ягод: малины, земляники, крыжовни-

ка, шиповника.

Извлечения ДНК из продуктов пи-

тания на основе растительного сырья

осуществляли с использованием

различных методов экстракции: 1)

метод фенольной экстракции; 2) ме-

тод с применением коммерческого

набора «ПРОБА–ЦТАБ» (комплект

реагентов для выделения раститель-

ной ДНК); 3) метод с применением

коммерческого набора «Сорб-ГМО-

А». Степень чистоты выделенных

нуклеиновых кислот, т. е. наличие в

реакционной смеси тех или иных

ингибиторов, определяли с помощью

спектрофотометрического метода

анализа.

В ходе исследования все рассмот-

ренные методы позволили выделить

ДНК из исследуемых образцов неза-

висимо от используемого объекта. В

табл. 1 дана сравнительная характе-

ристика чистоты выделенной ДНК из

продовольственного сырья.

Степень чистоты выделения дезок-

сирибонуклеиновых кислот определя-

ли высокочувствительным, простым в

исполнении спектрофотометричес-

ким методом, основанным на погло-

щении монохроматического потока

световой энергии при прохождении

его через исследуемый раствор. Дан-

ные, представленные в табл. 1, пока-

зывают, что чистота ДНК при А

260/280

нм всех категорий фруктово-ягодных

смесей при выделении ДНК первым

методом составляет от 1,76 до 1,77;

вторым и третьим (с применением

наборов «ПРОБА–ЦТАБ» и «Сорб-

ГМО-А») – от 1,98 до 2,01 и от 1,94 до

1,98 соответственно. При этом кон-

центрация выделенной ДНК состав-

ляет при выделении ДНК первым

методом от 0,35 до 0,36 , мг/г продук-

та, вторым – от 0,38 до 0,40 мг/г про-

дукта, третьим – от 0,42 до 0,45.

Следовательно, несмотря на то, что

оба коммерческих набора для выде-

ления ДНК позволяют получить рас-

тительную ДНК одинаковой чистоты,

третий набор обеспечивает выделе-

ние более высокого количества ДНК.

Далее исследовали влияние техно-

логической обработки плодово-ягод-

ного сырья на эффективность видо-

вой идентификации с помощью по-

лимеразной цепной реакции.

Интерпретацию результатов ПЦР-

анализа по определению видовой и

родовой принадлежности исследуе-

мых проб проводили при помощи

сконструированных положительных

контролей. Продукты амплификации

положительных контролей на элект-

рофореграмме представляли собой

яркую четкую полосу. Если на элект-

рофореграмме размер ампликонов

соответствовал ПЦР-ампликону поло-

жительного контроля, то такие образ-

цы считали «положительными», т. е.

содержащими ДНК соответствующего

объекта плодово-ягодного сырья.

Для контроля реагентов, использу-

емых для ПЦР-анализа, на предмет

контаминации ампликонами приме-

няли отрицательный контроль, с ис-

пользованием ионизованной воды.

В электрофоретической дорожке с

отрицательным контролем окрашен-

ные полосы должны были отсутство-

вать. Допускалось присутствие толь-

ко одной слабо окрашенной полосы,

формирующейся неиспользованны-

ми в ходе ПЦР праймерами и со-

ставляющей по размеру менее 50

п.н. В противном случае результаты

Таблица 1

Сравнительная характеристика методик выделения ДНК из

продовольственного сырья

Таблица 2

Результаты анализа видовой идентификации при помощи ПЦР

еинавонемиаН

ялдаробан

KНДяинеледыв

яинаводелсситкеъбО

KНДатотсиЧ

082/062Аирп

яицартнецноK

йоннеледыв

г/гм,KНД

-инлоподС

йоньлет

йеицкартскэ

молонеф

еовониламолдивоП

77,1

53,0

еончинялмезолдивоП

67,1

63,0

акинвожыркзиолдивоП

67,1

53,0

акинвопишзиолдивоП

67,1

63,0

»БАТЦ–АБОРП«

еовониламолдивоП

89,1

93,0

еончинялмезолдивоП

99,1

93,0

акинвожыркзиолдивоП

89,1

04,0

акинвопишзиолдивоП

00,2

93,0

»А-ОМГ-броС«

еовониламолдивоП

79,1

34,0

еончинялмезолдивоП

89,1

54,0

акинвожыркзиолдивоП

79,1

44,0

акинвопишзиолдивоП

79,1

34,0

1 2 3 4 5 6 7

ацзарбоеинавзаН

–

%001,еовониламолдивоП

%001,еончинялмезолдивоП

%001,акинвожыркзиолдивоП

%001,акинвопишзиолдивоП

–

акосоговеншив%04,еончинялмезолдивоП

+ –

акосоговеншив%04,еовониламолдивоП

+ +

–

акосоговеншив%04,акинвожыркзиолдивоП

–

+ +

акосоговеншив%04,акинвопишзиолдивоП

кинвожырк–3;)airagarF(акинялмез–2;)subuR(анилам–1:яиначемирП

ивик–7;)asuM(нанаб–6;)sunurP(яншив–5;)asоR(кинвопиш–4;)sebiR(

йыньлетацирто––;яинаводелсситатьлузерйыньлетижолоп–+;)aidinitcA(

.яинаводелсситатьлузер

Электронная Научная СельскоХозяйственная Библиотека