ЭлБиб

СОСТОЯНИЕ ВСЕМИРНЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИХ РЕСУРСОВ ЖИВОТНЫХ

В СФЕРЕ ПРОДОВОЛЬСТВИЯ И СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА

РАЗДЕЛ

362

Адаптация и устойчивость к заболеваниям – комп-

лексные неморфологические признаки, их нелегко

измерить. Их можно исследовать в экспериментах,

в которых животные подвергаются специфическим

средовым воздействиям или инфицируются соответ-

ствующими агентами. Однако такие эксперименты

трудоемки и дорогостоящи и поднимают вопросы о

защите животных. Именно поэтому чрезвычайный

интерес исследователей вызывает идентификация

генов, контролирующих сложные признаки. Для

выявления таких генов используются разные под-

ходы. Созданные инструменты для выявления функ-

циональной изменчивости описаны в главе 3.3.

Краткий обзор

молекулярных методов

В этом разделе описаны наиболее важные современ-

ные молекулярные методы, разработанные для оце-

нок генетического разнообразия и выявления функ-

циональных вариантов. Во вставке 73 описывается,

как ДНК и РНК экстрагируются из биологического

материала и подготавливаются для анализа. Харак-

теристики чаще всего используемых молекулярных

маркеров приведены во вставке 74, и составление

выборок (очень важный аспект молекулярных ис-

следований) обсуждается во вставке 75.

Полиморфизм белков был первым поколением

маркеров, используемых для генетических иссле-

дований домашних животных. Однако количество

полиморфных локусов, доступных для анализа, и

уровень их наблюдаемого полиморфизма часто низ-

ки, что сильно ограничивает их применение в иссле-

дованиях генетического разнообразия. Благодаря

развитию новых технологий, полиморфизмы ДНК

стали предпочтительными маркерами в исследова-

ниях генетической изменчивости с использованием

молекулярных методов (вставка 74).

3.1 Методы, использующие

ДНК-маркеры для оценки

генетического разнообразия

Маркеры ядерной ДНК

В настоящее время для определения полимор-

физма ядерной ДНК в распоряжении имеется ряд

Вставка 73

Экстракция и наработка ДНК и РНК

Первый шаг в анализе ДНК, РНК и белка – их вы-

деление из биологического образца и очистка. Для

этого имеется целый ряд протоколов и готовых реак-

ционных смесей (китов). Применяемая стратегия

определяется источником материала и выделяемыми

молекулами. Например, экстракция ДНК из цельной

крови или лейкоцитов относительно легка, в то время

как ее экстракция из обработанных пищевых продук-

тов много труднее. Экстракция РНК из поджелудочной

железы очень трудна из-за высокой скорости процес-

сов посмертной деградации в этом органе. Очистка

ДНК, РНК и белков является ключевым фактором, от

которого зависит надежность конечного результата.

После выделения ДНК (или РНК) из клеток, следую-

щим шагом является получение тысяч или миллионов

копий определенного гена или участка ДНК. Фрагмент

ДНК может быть размножен в микроорганизмах, обыч-

но

E. coli

, или

in vitro

с использованием полимеразной

цепной реакции (ПЦР). Этим методом, принесшим

Нобелевскую Премию его создателю, Кэри Мюллису,

экспотенциально умножают (амплифицируют) лю-

бой сегмент ДНК с известной последовательностью.

Ключевым компонентом в ПЦР является ДНК-полимера-

за, выделенная из

Thermus aquaticus,

микроорганизма,

адаптированного к жизни и размножению при очень

высоких температурах. Эта термостабильная

Taq

полимераза (по названию

Thermus aquaticus

) обеспе-

чивает репликацию цепей ДНК в циклическом режиме

и приводит к геометрическому росту количества копий

ДНК – мишени амплификации. Цикл ПЦР включает три

этапа: i) денатурация ДНК при 90–95˚C для разделения

молекулы ДНК на две одноцепочечные последова-

тельности, которые служат матрицами; ii) отжиг пар

коротких одноцепочечных олигонуклеотидов (праймеров,

или затравок), комплементарных к областям – мишеням,

фланкирующим амплифицируемый фрагмент (фрагмент

интереса), при 45–65˚C; iii) удлинение вновь синтезируе-

мых цепочек ДНК, начиная от праймеров, осуществляе-

мое Taq-полимеразой при 72˚. Этот цикл повторяется,

обычно 25-45 раз, позволяя накапливать достаточное

количество ампликонов (фрагмент гена или ДНК, синте-

зируемый с использованием ПЦР) для анализа.