ЭлБиб

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ РАСТЕНИЙ. СОМАТИЧЕСКАЯ ГИБРИДИЗАЦИЯ

АГРОБАКТЕРИАЛЬНАЯТРАНСФОРМАЦИЯ

CEMЯН ARABIDOPSIS

THALIANA

ТомиловА.А.,ЛевченкоН.Б.,ОгарковаО.А., ТарасовВ.А.

ИнститутОбщей Генетики им. Н.И. ВавиловаРАН, лаборатория изменчивости

генома, Москва 117809, ул. Губкина 3. E-Mail:

tarasov@vigg.ru

A. thaliana

является модельным объектом исследований в области

молекулярной генетики растений, имеющим значительные

преимущества, такие как короткий жизненный цикл, малые размеры,

небольшой геном и хорошо развитые подходы классической генетики.

В перспективе, коллекции из 50-100 тысяч независимых инсертантов

было бы достаточно для обеспечения 95% вероятности того, что каждый

ген содержит инсерцию. Метод трансформации

A. thaliana

in planta был

впервые предложен Фельдманом и Марксом в 1987 году. Этот метод,

не требующий стадии работы с культурой ткани, включает в себя

инфицирование прорастающих семян A. thaliana агробактерией

Agrobacterium tumefaciens

и позволяет получать трансформантов, не

имеющих сомаклональной изменчивости. Нами была проведена

ультразвуковая предобработка семян в водном растворе, содержащем

окись алюминия. Это позволило увеличить (более чем в 10 раз) частоту

трансформации: выход GUS-экспрессирующих растений составил 2-

5% семян Т2 поколения. Для трансформации использовалась бинарная

векторная система pLD3, сконструированная нами ранее на базе вектора

рВ1121. Модификация состоит во введении в Т-областъ между генами

NPT-II и GUS гена резистентности к антибиотику хлорамфениколу,

выражающемуся в клетках

E.coli,

что позволяет облегчить процесс

последующего клонирования мутантных генов.

В результате, была получена коллекция растений

поколения А

thaliana,

имеющих устойчивость к канамицину. Гистохимическое

определение GUS- активности позволило отобрать около 150 GUS-

экспрессирующих растений, некоторые из которых имели значительные

морфологические изменения. Наличие инсерции в геноме отобранных

растений было доказано методом ПЦР с одной парой праймеров к GUS-

гену в Т-ДНК. Из полученных трансгенных растений была создана

коллекция каллусных культур, которая используется для амплификации

окружения инсерции с помощью метода ГИДР и/или для клонирования

мутантных генов в

E.coli

с последующим секвенированием.

3 0 8

Научная электронная библиотека ЦНСХБ