ЭлБиб

Ñàäîâîäñòâî è âèíîãðàäàðñòâî, ¹ 2, 2014

Çàùèòà ðàñòåíèé

Количество и качество исследуемой ДНК

непосредственно влияет на ход полимеразной

цепной реакции. Известно, что присутствие

в исследуемом образце в высокой концен-

трации растительной ДНК может привести

к получению ложноотрицательных результа-

тов или ингибированию полимеразноцепной

реакции (ПЦР). Поэтому, на этапе отбора

материала для молекулярно-биологического

исследования необходимого учитывать его

количество, а также соотношение ДНК воз-

будителя и растения-хозяина (в работе с био-

приманками ДНК растительной ткани листа)

в образце. Отбор оптимального количества

исследуемого материала – один из показате-

лей, который во многом определяет достовер-

ность диагностики фитофторозов.

Для определения оптимальной массы за-

раженной ткани биоприманки, необходимой

для выявления возбудителя фитофтороза, был

проведен модельный опыт по искусственно-

му заражению биоприманок видом

Ph. citri-

cola.

Полученные результаты показывают, что

с увеличением массы растительной ткани, от-

бираемой для исследования, возрастала масса

мицелия возбудителя. Значения порогового

цикла детекции флуоресценции отличались

при использовании ДНК навесок заражен-

ной ткани биоприманки массой от 1 до 60 мг.

Максимальное количество мицелия 2838,0

мкг выявлено в навесках массой 60 мг, что

можно было предположить. Однако из 5-ти

повторностей одинаковой массы положитель-

ный результат был получен только в одной.

Эти данные свидетельствуют о том, что при

больших количествах отбираемого материала

возможность идентифицировать возбудителя

сокращается. Вероятнее всего, это связано с

увеличением в образце растительной ДНК,

что приводит к ингибированию ПЦР.

С уменьшением количества отбираемой

ткани листа начинает повышаться количество

положительных образцов в каждой 5-крат-

ной повторности. При отборе от 1 до 15 мг

пораженной ткани количество детекций флу-

оресценции по красителю ROX наибольшее

по сравнению с остальными навесками, что

говорит об увеличении специфичности ПЦР.

При величине навески биоприманки до 5

мг детекция флуоресценции происходит во

всех 5-ти повторностях, значение порогового

цикла в среднем составляет 29,9, ВПК сра-

батывает также в 5 образцах, что свидетель-

ствует об отсутствии ингибиторов в реакции.

Можно предположить, что такое количество

отбираемого образца является наиболее опти-

мальным по сочетанию в себе количества воз-

будителя и растительной ткани.

При массе биоприманки 1 мг, 10 мг и 15 мг

количество образцов с отсутствием детекции

флуоресценции начинает увеличиваться, что

свидетельствует о снижении специфичности

реакции.

Выводы

Для диагностики возбудителей фитофтороз-

ных корневых гнилей малины и земляники ме-

тодом ПЦР «в реальном времени» выделение

ДНК из биоприманок необходимо проводить

по методике, описанной J.J. Doyle [2]. Уста-

новлено, что выделение ДНК из биоприманок

для молекулярной диагностики фитофторозов

необходимо проводить из образца массой 5 мг,

отобранного в месте некроза или на границе

здоровой и пораженной ткани приманки.

Литература

Головин С.Е.

Методические указания по диа-

гностике и учету болезней корней и стеблей земля-

ники и малины, передающихся через почву. – M.:

ВСТИСП, 2001. – 42 с.

Doyle J.J., Doyle J.L.

Isolation of plant DNA

from fresh tissue // Focus. Life technolog. inc.,

1990. – V. 12. – P. 13-15.

Huges K.J., Inman D.J., Cooke D.E.L.

Com-

parative testing of nested PCR-based methods with

bait-plant tests for detecting

Phytophthora fragariae

var. fragariae

in infected strawberry roots from fruit

crops in the UK // OEPP/EPPO Bulletin, 2000. –

V. 30. – P. 533-538.

Laurent A.S., Merwin I.A., Thies J.E.

Long-

term orchard groundcover management system affect

soil microbial communities and apple replant disease

severity // Plant Soil., 2008. – Vol. 304. – P. 209-225.

S.E. Golovin,

M.B. Kopina

All-Russian Horticultural Institute for Breeding, Agrotechnology and Nursery,

Russian Center for Quarantine

Optimization of DNA extraction from vegetable baits

for diagnosis by PCR method of Phytophthora infections of raspberries

and strawberries in the soil

Электронная Научная СельскоХозяйственная Библиотека