ЭлБиб

40 / 52

Ñàäîâîäñòâî è âèíîãðàäàðñòâî, ¹ 2, 2014
38
Çàùèòà ðàñòåíèé
С.Е. Головин,
доктор сельскохозяйственных наук, заведующий
лабораторией фитопатологии и энтомологии
ГНУ ВСТИСП Россельхозакадемии
E-mail:
М.Б. Копина,
кандидат сельскохозяйственных наук, научный сотрудник
ФГБУ Всероссийский центр карантина растений
E-mail::
УДК 634.75:632.2
Оптимизация выделения ДНК из биоприманок
для диагностики методом ПЦР возбудителей фитофторозов
малины и земляники в почве
Сочетание методов биоприманок и ПЦР явля-
ется одним из перспективных направлений для
диагностики почвы на присутствие видов из
рода Phytophthora. Тем не менее, при совмест-
ном использовании этих двух методов воз-
никает ряд проблем, которые ограничивают
эффективность такого сочетания. Проведен-
ные исследования по оптимизации выделения
ДНК из растительных приманок при диагно-
стике возбудителей фитофторозов позволили
определить оптимальные условия пробоподго-
товки. Так, выделение ДНК, согласно наборам
“Loewe” для диагностики Ph. fragariae и Phyto-
plasma, позволяет получать ДНК возбудителя
приемлемой чистоты (соотношение 260/280
варьировало от 1,76 до 1,98; соотношение
260/230 составляло от 1,21 до 1,86). Несмотря
на то, что концентрация выделенной ДНК зна-
чительно меньше по сравнению с ранее описан-
ными методами (от 33,3 до 104,9 нг/мкл), при
постановке ПЦР «в реальном времени» были
получены положительные результаты. Для
определения оптимальной массы зараженной
ткани биоприманки, необходимой для выявле-
ния возбудителя фитофтороза, был проведен
модельный опыт по искусственному зараже-
нию биоприманок видом Ph. citricola. Результа-
ты опыта показали, что при массе биоприман-
ки 1 мг, 10 мг и 15 мг количество образцов с от-
сутствием детекции флуоресценции начинает
увеличиваться, что свидетельствует о сниже-
нии специфичности реакции. Для получения до-
стоверных результатов необходимо отбирать
5 мг образца на границе здоровой и пораженной
ткани приманки и проводить выделение ДНК
согласно инструкции к набору «Loewe» для диа-
гностики Ph. fragariae.
Ключевые слова: ДНК, биоприманки, молеку-
лярные методы, фитофторозы.
The combination of PCR and bait methods is
one of the promising areas for the diagnosis
of the presence of soil species of the genus
Phytophthora. However, when combining
these two methods, there are a number of
problems that limit the effectiveness of such a
combination. Studies on optimization of DNA
extraction from vegetable bait in the diagno-
sis of phytophthora infections were permitted
to determine the optimal conditions for sam-
ple preparation. Thus, according to the DNA
extraction kits “Loewe” for diagnosis Ph.
fragariae and Phytoplasma produces DNA
pathogen acceptable purity (ratio of 260/280
ranged from 1.76 to 1.98, the ratio of 260/230
ranged from 1.21 to 1.86). Despite the fact that
the concentration of the isolated DNA is sub-
stantially less in comparison with previously
described methods ( from 33.3 to 104.9 ng/ml )
in the formulation PCR “real time” positive
results were obtained. To determine the opti-
mal weight infected tissue bait it`s necessary
to detect of phytophthora infections, was
held model experiment on artificial infec-
tion bait views Ph. citricola. The test results
showed that the weight bait 1 mg, 10 mg and
15 mg of the number of samples to detect the
absence of fluorescence begins to increase,
indicating a reduction in the specificity of
the reaction. Thus, to obtain accurate mea-
surements, it`s necessary to select 5 mg of
the sample boundary healthy and diseased
tissue and hold the bait DNA isolation kit ac-
cording to instruction “Loewe» for diagnos-
ing Ph. fragariae.
Key words: DNA, vegetable bait, molecular
methods, late blight.
Электронная Научная СельскоХозяйственная Библиотека