43 / 52
41
Ñàäîâîäñòâî è âèíîãðàäàðñòâî, ¹ 2, 2014
Çàùèòà ðàñòåíèé
При исследовании возбудителей фитофто-
розов в ткани пораженной биоприманки необ-
ходимо учитывать возможность отбора образца
с низким содержанием патогена. В этом случае
даже небольшая потеря нуклеиновых кислот
может дать ложноотрицательный результат.
Для достоверной диагностики на ранних эта-
пах поражения фитофторозом ткани листа сле-
дует отбирать ту часть, где количество возбуди-
теля наибольшее. В связи с этим, следующим
этапом нашей работы было определение мак-
симальной концентрации видов
Phytophthora
в
ткани зараженной биоприманки.
Для определения наибольшей концентра-
ции мицелия возбудителя в биоприманке,
искусственно зараженной фитофторозом, де-
лали высечки из здоровой ткани, прилегаю-
щей к некрозу, некротизированной ткани, а
также на границе некротизированной и здо-
ровой ткани листа. В качестве отрицатель-
ного контроля использовали здоровую ткань
приманки, максимально удаленную от некро-
за. Из отобранных высечек выделяли ДНК со-
гласно инструкции производителя к набору
«Loewe» для идентификации
Ph. fragariae
,
и проводили ПЦР «в реальном времени» со
специфичными зондами. Результаты приме-
нения метода серийных разведений для оп-
тимизации выделения ДНК из биоприманок
представлены в табл. 2.
Рис. Электрофореграмма продуктов амплификации с праймерами Yph1F и Yph2R.
Методы выделения ДНК дорожки 1, 2 – ChL+СТАВ; 3, 4 – LiCl 8М+СТАВ;
5, 6 – ChL+СТАВ (оптимизированный); 7, 8 – «ДНК-Экстран»; 9, 10 – «Проба ГС»;
11, 12 – «Сорб-ГМО-А»; 13, 14 – «Сорб-С»; 15, 16 – «Loewe»
Phytophthora fragariae
;
17, 18 – «Loewe»
Phytoplasma;
19 – вода; 20 – положительный контроль
Таблица 2
Зависимость количества возбудителя от места отбора
пораженной ткани в биоприманке
Часть биоприманки
Количество пропагул, шт.
Среднее
значение*
Некроз
2253,1 549,2 7522,1 3609,8
724,1
2931,6 а
Здоровая ткань
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0 б
Граница между некрозом и
здоровой тканью
6613,7 2112,4 6708,1 2478,5
1902,9
3963,1а
Некроз до здоровой ткани 1861,0 3019,9 1844,7 7884,3
4037,1
3729,4 а
Здоровая ткань до некроза
68,6
14,8
0,0
64,3
0,0
29,5 б
Примечание: *Статистическая обработка по критерию Дункана в программе Statisticа 5,0
Из этих данных видно, что набольшее коли-
чество пропагул было обнаружено на грани-
це некротизированной и живой ткани листа,
что соответствует паразитизму возбудителя.
При сравнении разных мест отбора ткани из
биоприманки для выделения ДНК возбудите-
лей
Phytophthora sp
. было установлено, что
между вариантами «Некроз», «Некроз + Здо-
ровая ткань» и «Некроз до Здоровой ткани»
нет статистически достоверных различий.
Можно рекомендовать одно из указанных
мест в биоприманке для выделения ДНК в со-
ответствии с инструкцией к набору «Loewe»
(
Ph. fragariae
).
Электронная Научная СельскоХозяйственная Библиотека