42 / 52
Ñàäîâîäñòâî è âèíîãðàäàðñòâî, ¹ 2, 2014
40
Çàùèòà ðàñòåíèé
(соотношение 260/280 варьировало от 1,11
до 1,51; соотношение 260/230 составляло
менее 1,0).
Использование набора
«
Сорб-ГМО-А»,
выделение ДНК согласно набору «Loewe»
для диагностики
Ph. fragariae
и
Phytoplasma
позволяет получать ДНК возбудителя прием-
лемой чистоты (соотношение 260/280 варьи-
ровало от 1,76 до 1,98; соотношение 260/230
составляло от 1,21 до 1,86).
Несмотря на то, что концентрация выде-
ленной ДНК значительно меньше по сравне-
нию с ранее описанными методами (от 33,3
до 104,9 нг/мкл), при постановке ПЦР «в
реальном времени» были получены положи-
тельные результаты (табл. 1).
Таблица 1
Использование различных методов выделения ДНК из биоприманок
при проведении ПЦР «в реальном времени»
№
п/п Метод выделения ДНК Концентрация
ДНК нг/мкл 260/280 260/230
Сt
100 нг/реакцию
1 ChL+СТАВ
428,0
1,44
0,88
NA*
413,4
1,54
0,96
NA
2 LiCl 8М+ СТАВ
358,1
1,40
0,83
NA
352,5
1,48
0,90
NA
3 ChL+СТАВ
(оптимизированный)
159,6
1,51
0,96
NA
190,4
1,51
0,97
NA
4 «ДНК-Экстран»
229,6
1,70
0,04
NA
593,1
1,13
0,77
NA
5 «Проба ГС»
175,2
1,19
0,67
NA
145,2
1,18
0,89
NA
6 «Сорб-ГМО-А»
33,3
1,78
1,86
33,0
40,5
1,87
2,26
32,9
7 «Сорб-С»
155,9
1,11
0,28
NA
140,3
1,14
0,21
NA
8 Doyle J.J., Doyle J.L. (1990)
97,3
1,98
1,64
26,1
104,4
2,0
1,84
26,0
9 Loewe
Phytoplasma
104,9
1,76
1,21
31,5
93,4
2,59
1,44
32,9
Примечание: NA*– отсутствие сигнала флуоресценции
При внесении в реакционную смесь ДНК
Phytophthora
sp.
, выделенную в соответствии
с методикой к набору «Loewe» (
Ph .fragariae
),
значение С
t
составляло 26,0. Такое значение
было наименьшим по сравнению с другими
методами выделения ДНК, что указывает на
большее количество целевой ДНК, выделен-
ной из образца при применении этого метода.
Пороговый цикл (С
t
) при амплификации об-
разцов ДНК, выделенной с помощью набора
«
Сорб-ГМО-А» и согласно набору «Loewe»
для выявления
Phytoplasma,
имел большее зна-
чение и составлял 33,0 и 31,5 соответственно.
Как видно из рис., амплификация фраг-
мента гена Y pt с праймерами Yph1F Yph2R
прошла с образцами ДНК, выделенной
согласно инструкциямк наборам«Loewe», на-
личие продукта амплификации внутреннего
контроля свидетельствует об отсутствии
ингибирования ПЦР.
Сравнительный анализ 9 способов вы-
деления ДНК из искусственно зараженных
биоприманок оомицетами рода
Phytophthora
показал, что наиболее подходящим мето-
дом пробоподготовки является выделение
ДНК в соответствии с инструкцией к набору
«Loewe» для идентификации
Ph. fragariae
,
что было доказано постановкой классической
ПЦР и ПЦР «в реальном времени».
Электро ная Научная СельскоХозяйственная Библиотека