ЭлБиб

41 / 52

39
Ñàäîâîäñòâî è âèíîãðàäàðñòâî, ¹ 2, 2014
Çàùèòà ðàñòåíèé
Д иагностика возбудителей фитофто-
розов в почве с использованием мо-
лекулярных методов в настоящее время не-
совершенна. Для выявления возбудителей
в почвенных образцах продолжают широко
использовать биологические методы. Сочета-
ние методов биоприманок и ПЦР является од-
ним из перспективных направлений для диа-
гностики почвы на присутствие видов из рода
Phytophthora. Тем не менее, при совместном
использовании этих двух методов возникает
ряд проблем, которые ограничивают эффек-
тивность такого сочетания. В частности, вы-
деление ДНК Phytophthora spp. из биоприма-
нок, в отличие от чистых культур, осложнено
высоким содержанием растительного матери-
ала, бактериальных возбудителей, микроми-
цетов и других микроорганизмов, находящих-
ся в почвенных образцах [3, 4]. Поэтому ак-
туальной проблемой при исследовании ДНК
фитофторозов в растительной ткани остается
разработка методов экстракции, которые мог-
ли бы обеспечить получение нуклеиновых
кислот, пригодных для дальнейших анализов.
Материалы и методы
В работе использовали 2 штамма культур
Phytophthora spp., возбудителей фитофторо-
зов малины и земляники. Биоприманки закла-
дывали по методике С.Е. Головина [1].
Для определения наиболее подходящего
метода выделения ДНК из биоприманок про-
водилось заражение почвы гомогенизирован-
ным в воде мицелием Ph. cactorum. Из 7-ми
дневной культуры возбудителя, выращенной
на чашке Петри, делали высечки диаметром
10 мм. В колбу объемом 250 мл помещали вы-
сечки и добавляли 150 мл стерильной воды,
измельчали в гомогенизаторе при 2000 об/
мин. в течение 5 мин. Навеску почвы массой
36,7 г помещали в чашку Петри и заливали
15 мл полученного гомогенизата мицелия Ph.
cactorum , на поверхность которого помещали
листья малины. Инкубировали чашки Петри
при 15-18 ºС. На 3-5 день из некротизирован-
ных биоприманок вырезали кусочки расти-
тельной ткани размером 0,5х1,0 см и прово-
дили выделение ДНК.
Выделение ДНК из растительного матери-
ала и чистых культур проводили следующими
методами: с использованием наборов «Проба
ГС», («ДНК-Технология», Москва); «ДНК-
Экстран», «Сорб-ГМО-А», «Сорб-С» («Син-
тол», Москва); на основе метода выделения
CTAB-SDS
html), в отдельные этапы которого были вне-
сены изменения, в соответствии с инструкци-
ей к набору «Loewe» (Германия), для диагно-
стики Phytoplasma в сосудистой ткани вино-
града, а также согласно методике описанной
J.J. Doyle [2].
После выделения измеряли концентрацию
ДНК на спектрофотометре ND-2000 и ставили
ПЦР «в реальном времени». Концентрацию
ДНК при всех способах выделения выравни-
вали и вносили по 100 нг на одну реакцию.
Для определения оптимальной массы за-
раженной ткани биоприманки, необходимой
для выявления возбудителя фитофтороза, был
проведен модельный опыт по искусственно-
му заражению биоприманок видом Ph. citri-
cola. На 3-5 день стерильным лезвием из за-
раженной ткани листа вырезали кусочки на
границе здоровой и некротизированной ткани
массой 1 мг, 5 мг, 10 мг, 15 мг, 20 мг, 25 мг,
30 мг, 40 мг, 50 мг и 60 мг. После выделения
ДНК, согласно инструкции к набору «Loewe»
для диагностики Ph. fragariae, проводили по-
становку ПЦР «в реальном времени» с зон-
дом Ph.cit, специфичным для Ph. citricola.
Результаты и обсуждение
Результаты исследований показали, что все
испытанные способы выделения позволяют
получить образцы ДНК с высокой концентра-
цией (табл. 1). Тем не менее, при выделении
целевой ДНК возбудителя из листа биопри-
манки происходит выделение в большом ко-
личестве растительной ДНК, которая ингиби-
рует ПЦР. Поэтому при постановке ПЦР «в
реальном времени» с образцами ДНК, выде-
ленными методами №1-3, с использованием
наборов «ДНК-Экстран», «Сорб-С», концен-
трация которых была наибольшей среди всех
способов и составляла 145,2-428,0 нг/мкл,
флуоресценция по красителям не регистри-
ровалась, что говорит об отсутствии целевой
ДНК или её сильном ингибировании.
Степень чистоты образцов ДНК, выде-
ленных этими методами, была очень низкая
Электронная Научная СельскоХозяйственная Библиотека