ЭлБиб

иноделие

иноградарство

5/2015

виноГРАДАРСТВО

Дрожжевые грибы винограда:

видовое разнообразие

и методические аспекты

выделения

Д. А. Абдуллабекова,

канд. техн. наук;

Е. С. Магомедова,

канд. биол. наук;

Г.Г. Магомедов

Прикаспийский институт биологических ресурсов

рожжевые организмы играют

важную роль во многих при-

родных процессах. Они находят

широкое применение при решении

большого числа научных и практиче-

ских задач, стоящих перед биологи-

ей, микробной экологией, генетикой,

биотехнологией. Естественной средой

обитания и источником выделения

различных видов дрожжей, наряду

с коллекциями живых культур, оста-

ются растительные субстраты, в том

числе виноградное растение, микро-

биота которого, с характерным для не-

го видовым разнообразием дрожжей

традиционно служит объектом иссле-

дования во многих винодельческих

регионах. Результаты, полученные

при выявлении таксономического

состава дрожжевых грибов виноград-

ников, зависят от многих факторов.

В первую очередь, инвентаризацион-

ные списки определяются методами

учета дрожжей, сопряженными в ми-

кологии с трудоемкими и длительны-

ми анализами. Применяемый метод

дает возможность не только оценить

общее разнообразие и особенности

видовой структуры изучаемой группы

организмов, но и, по сути, определяет

границы этой группы [1].

Традиционно, изучение видового

состава дрожжевых сообществ осно-

вано на классическом микробио-

логичексом принципе, требующем

обязательного выделения и культи-

вирования на специальных питатель-

ных средах чистой культуры микро-

организмов.

На современном этапе в микроб-

ной экологии, наряду с культураль-

ными, предлагаются некультураль-

ные молекулярно-биологические

методы, существенно дополняющие

представления о видовом разнообра-

зии микробиоты [2]. Однако, в связи

со сложностью исполнения и высо-

кой стоимостью последние не нашли

широкого применения в эксперимен-

тальных исследованиях.

В зависимости от поставленной

цели способ выделения культуры

дрожжей позволяет либо обнаружить

и количественно учесть, либо только

обнаружить дрожжи в анализируемом

субстрате. В первом случае, чистую

культуру, чаще всего, изолируют пу-

тем посева на плотную питательную

среду клеток дрожжей, после их пред-

варительной десорбции с исследуемо-

го субстрата. Во втором, применяют

метод накопительных культур, когда

жидкую среду инокулируют смешан-

ной популяцией субстрата, где проис-

ходит рост приспособленных к нейми-

кроорганизмов, которые затем также

рассевают на агаризованные среды.

Для выявления таксономического

разнообразия дрожжей виноградни-

ков целесообразно оценить возмож-

ности метода прямого посева и мето-

да накопительных культур при каче-

ственном учете дрожжей.

Цель исследований

— выявить

видовой состав дрожжевых грибов,

ассоциированных с виноградом,

при различных методических под-

ходах.

Материалы и методы исследова-

ний.

Исследования проводили на ви-

нограднике, расположенном в Даге-

стане. Субстратом для выделения

дрожжей служили ягоды винограда

сорта Ркацители, которые отбирали

в 9 точках участка в период их техни-

ческой зрелости.

При учете дрожжей методом пря-

мого посева проводили десорбцию

клеток на вортексе в течение 10 мин.

Масса навески и объем воды состав-

ляли разведение 1:2, из которого

отбирали аликвоты 0,1 мл и высе-

вали на 3 чашки Петри с глюкозо-

пептонной-дрожжевой средой.

Для подавления роста бактерий при-

меняли антибиотик левомицетин.

Для проведения исследований

методом накопительных культур

из гроздей, отобранных в тех же 9

точках, получали сок с соблюдением

необходимых мер стерильности. По-

лученный сок разливали в стериль-

ные закупоренные ватными пробка-

ми склянки объемом 500 см

, достав-

ляли в лабораторию и проводили

посевы в чашки Петри с глюкозо-

пептонной-дрожжевой средой. С це-

лью выявления всего спектра видов

дрожжей высевы проводили в дина-

мике через каждые 3–4 сут до оста-

новки ферментации.

Посевы, при обоих методах выде-

ления дрожжевых грибов, инкуби-

ровали при комнатной температуре,

учет выросших колоний проводили

на 5–6 сут. По 2–3 колонии каждого

типа выделяли в чистую культуру

для дальнейшей идентификации.

Видовую идентификацию дрож-

жевых грибов проводили на основе

анализа нуклеотидных последова-

тельностей ITS1–5, 8S-ITS2 региона

и D1/D2 доменов региона 26S (LSU)

рДНК. Выделение ДНК и прове-

дение ПЦР осуществляли по ранее

описанной методике [3]. Для ампли-

фикации применяли праймеры:

ITS1f (5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTA)

и NL4 (5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG).

Секвенирование амплифици-

рованного региона проводили

в Научно-производственной компа-

нии «Синтол» (Москва). Видовую

идентификацию осуществляли путем

сравнения полученных нуклеотид-

ных последовательностей с данны-

ми, размещенными в генбанке NCBI

(ncbi.nlm.nih.gov) и базе данных CBS

(cbs.knaw.nl

УДК 582.282.23: 634.8 (470.67)

Электронная Научная СельскоХозяйстве ная Библиотека