ЭлБиб

162

НАУКА

ПРОИЗВОДСТВУ

Для выделения фермента 130 г почек гомогенизировали в 2,5 объ

емах 50 мМ трис-HCl буфера, pH 7,3, содержащего 0,15 М KCi, 0,2 мМ

ЭДТА, и центрифугировали 30 мин при 30000 об/мин. Супернатант

фракционировали сульфатом аммония в диапазоне 35-60% степени

насыщения, осадок растворяли в 20 мМ трис-HCl буфере, pH 7,5, со

держащем 50 мМ NaCl, 0,2 мМ ЭДТА и хроматографировали на ко

лонке с сефакрилом S-200. Фракции с НТФазной активностью объеди

няли и наносили на колонку с ДЭАЭ-тойоперлом 65ОМ, уравновешен

ной тем же буферным раствором. Адсорбированный белок элюировали

возрастающим градиентом NaCl от 50 до 500 мМ. Фракции, содержа

щие ферментативную активность, объединяли, высаливали сульфатом

аммония при степени насыщения 65%, осадок растворяли в буфере и

хроматографировали на колонке с тойоперлом HW-60. Активные

фракции объединяли и пропускали через колонку с 5'-АМФ-сефарозой

4В. НТФаза не связывалась с носителем, элюируясь из колонки в ре

зультате ее промывания буферным раствором. Удельная активность

полученного препарата составляла 3,8 мкмоль/мин/мг и возрастала по

сравнению с экстрактом в 50 раз.

Фермент характеризовался широкой специфичностью по отноше

нию к нуклеозидтрифосфатам, но не катализировал гидролиз нуклео-

зидди- и монофосфатов. Наиболее высокая скорость реакции наблюда

лась при использовании в качестве субстратов ГТФ, ИТФ и УТФ; ско

рость гидролиза АТФ иЦТФ по. сравнению с ГТФ составляла 6-7%.

НТФаза активировалась катионами двухвалентных металлов, эффект

которых убывал в ряду Mn2+>Mg2+>Ca2+>Co2+. Кинетические исследо

вания показали, что фермент проявляет оптимум активности при pH

7,0. Зависимость начальной скорости реакции от концентрации ИТФ

описывалась гиперболической кривой насыщения в диапазоне концен

траций субстрата 0,1-1,5 мМ. Константы Михаэлиса для ИТФ и сво

бодных ионов Mg2+, рассчитанные в координатах Хейнса, составили

соответственно 1,15 мМ и 0,61 мМ.

Работа выполнена при финансовой поддержке Белорусского рес

публиканского фонда фундаментальных исследований, грант Б97М-

091.

Электронн я Научная СельскоХозяйственная Библиотека