230 / 294
для отбора клеточных культур клевера лугового с встроенными генами
n p t l l
) и 500 мг/л цефотаксима для подавления роста агробактерий. Ка-
намицин добавляли в среды в продолжение всего процесса трансформа
ции и поддержания
in vitro
коллекции трансформированных морфоген
ных культур клевера лугового. Субкультивирование на средах с цефо-
таксимом проводили каждые 3-4 недели, снижая постепенно его кон
центрацию до
0
мг/л до полной элиминации агробактерий.
Подтверждение наличия генов
nptll
(маркерный),
ас-ар
(целевой)
в полученных растениях определяли методом ПЦР. При этом очень
важным моментом является то, что анализ проводили у растений, вы
ращиваемых на среде Гамборга без добавления клафорана (цефотакси
ма) при условии отсутствия агробактериальной инфекции, что исключа
ло из анализа нетрансгенные растения, дающие положительный резуль
тат по ПЦР за счет остаточной контаминации агробактериями.
В связи с тем, что в исследуемых растениях могут присутствовать
собственные гены пептидных антибиотиков, гомологичные введенным
трансгенам, для идентификации трансгенных растений методом ПЦР
мы использовали праймеры, комплементарные промоторной области
35S
вируса мозаики цветной капусты и концевому участку гена
ас-ар.
Были проанализированы растения из следующих вариантов опы
та:
№
1
LGVac2
№
2
L G V a c lS I J
№
3
A4rsl
№
4 A4rs6
№
6
A4acl
2 0 0
№
7
A4rs211
№ 8
A4rs21 II
№
9
A4rs61
№ 10
P8
— контроль,
^трансформированное
ра ст ени е
ПЦР-анализ с праймером
nptl/npt2
при температуре отжига 50 °С
показал амплификацию всех тестируемых образцов, кроме № 7, с един
ственным специфичным фрагментом на уровне свечения плазмиды раз
мером 580—590 пар нуклеотидов (рис. 2). В контрольном образце ис
ходного растения (дорожка № 5 на рис. 2) амплификацию не наблюда
ли.
При ПЦР-анализе исследуемых образцов на наличие целевого ге
на дефензина амаранта
(ас)
установлено, что при использовании комби
нации праймеров
35S/ac
при температуре отжига 52 °С наблюдали ам
плификацию образцов, трансформированных штаммом агробактерии с
геном дефензина амаранта при отсутствии амплификации в контроль
ном нетрансгенном растении (рис. 3 — дорожки 6,7,8, образцы
LGVac2;
LGVacl5II; A4acl 200),
что свидетельствует о наличие встраиваемых ге
нов в геноме изученных образцов
Все трансформированные морфогенные культуры клевера лугово
го сохраняли признак кислотоустойчивости на агаризованной питатель-
227
Научн я электронная библиотека ЦНСХБ