ЭлБиб

ные животные и реагирующие на антиген р24 в РИД), РИД(+) и РИД(-).

Серологические методы. Выявляли антитела к ВЛКРС с помощью реак

ции иммунодиффузии (РИД) в агаровом геле, используя набор для серологи

ческой диагностики лейкоза КРС производства Курской биофабрики соглас

но наставлению производителя. А также методом иммуноферментного ана

лиза (ИФА) в соответствии с временным наставлением по применению набо

ра для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС)

производства НПО «Нарвак» (Россия). Учет и интерпретацию результатов

реакции осуществляли визуально и инструментально. Оптическую плотность

продукта иммунохимической реакции в каждой лунке измеряли на автома

тическом анализаторе (типа «Мультискан») при длине волны 450 нм.

Гематологический метод. Производили подсчет абсолютного количе

ства лейкоцитов в 1 мкл периферической крови - микроскопией в камере

Горяева, а лимфоцитов - методом фазово-контрастного микроскопирова-

ния, с применением КФ-4.

Молекулярный метод. Образцы ДНК исследовали в ПЦР при помощи

набора для экспресс-индикации ДНК профага вируса лейкоза КРС (BLV)

методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) согласно инструкции по

применению производства «ЛАГИС»(Россия).

Праймерная пара Env (envelope), используемая в наборе, фланкирует

фрагмент оболочечного гена длиной 346 п.н. и предназначена для скрининго

вой детекции всех вариантов ДНК BLV, являясь маркером профага. Ампли

фикацию проводили в реакционной смеси, содержащей 0,5 мкг ДНК, 9 мкл

буфера, 1мкл раствора MgClj, 1 мкл смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов и

праймеров и 0,3 мкл Taq-полимеразы под 20 мкл минерального масла в пла

стиковых пробирках объемом 0,5 мл. Смесь помещали в амплификатор ‘Тер-

цик” с заданной программой температурно-временных циклов: ’’горячий

старт” при 95 °С в течение 3 мин; 1-й цикл включал денатурацию при 95 °С—

15 сек, отжиг при 60 °С — 15 сек, полимеризацию при 72 °С — 15 сек, 5

повторов; 2-й цикл— денатурацию при 95 °С в течение 10 сек, отжиг при 60 °С

— 10 сек, полимеризацию при 72 °С— 10 сек, 32 повтора; 3-й цикл— денату

рацию при 95 °С в течение 15 сек, отжиг при 56 °С— 10 сек, полимеризацию

при 72

°С

— 3 мин, однократно. После амплификации 10 мкл пробы анализи

ровали с помощью электрофореза в 1,5 % агарозном геле с последующим

окрашиванием в растворе бромистого этидия с концентрацией 1 мг/мл; в

качестве маркера молекулярного веса брали 100 Ьр “СибЭнзим”. Для визуа

лизации электрофореграмм использовали УФ-лампу.

Результаты исследований и обсуждение

Результаты исследования образцов крови различными методами пред

ставлены в табл

306

Научная электронная библиотека ЦНСХБ