ЭлБиб

обнаружить вирусный геном методом ПЦР. Были сконструиро

ваны и синтезированы 5 праймеров, которые позволяли приме

нить технику гнездовой ПЦР, предусматривающую последова

тельное проведение реакции в два этапа (ПЦР-1 и ПЦР-2). Раз

личные попарные сочетания этих праймеров были проверены на

коммерческих образцах штаммов Van Roekel и Calnek 1143. Ока

залось, что все праймеры в ПЦР-1 успешно выявляли геном

штамма Van Roekel, но не штамма Calnek 1143. Последний уда

валось обнаружить лишь с помощью гнездовой ПЦР. Эти факты

позволили предположить, что структура используемых прайме

ров не полностью соответствует геномной последовательности

штамма Calnek 1143. Чтобы выяснить этот вопрос, мы отсекве-

нировали 3-концевой фрагмент генома шт. Calnek 1143 и срав

нили его с аналогичной последовательностью шт. Van Roekel.

Действительно, несколько нуклеотидных замен в штамме Calnek

1143 были расположены в области связывания с праймерами. С

учетохМ полученных данных были рассчитаны и синтезированы

праймеры А0, А2, ВЗа и mkd3 со структурой, универсальной для

обоих исследуемых штаммов вируса НЭП.

Система из внешних А

-В3а (ПЦР-

) и внутренних A2-mkd3

(ПЦР-2) пар праймеров образует в ПЦР фрагменты ДНК размером

около 580 н.п. и 300 н.п. соответственно. Ее проверили на ком

мерческих препаратах штаммов Calnek и Van Roekel, и, получив

удовлетворительные результаты, определили чувствительность

метода. С этой целью приготовили серию

1 0

-кратных разведений

вируса на фосфатном буферном растворе, которые использовали

как для анализа в ПЦР, так и для заражения

-дневных SPF ку

риных эмбрионов. При определении инфекционности вируса

титрованием по методу Кербера-Ашмарина титр инфекционности

вируса составил 10

7 ’2

ЭИДзо/мл. При этом в 7-м разведении у

инфицированных эмбрионов не наблюдали никаких видимых от

личий от контрольных (табл. 1). Методом ПЦР вирусный геном

удалось обнаружить в четырех разведениях после ПЦР-1 и в

восьми разведениях после ПЦР-2. Таким образом, чувствитель

ность метода для ПЦР-1 составила не менее 10

ЭИДзо/мл и

около

ЭИД

5 0

/м л для гнездовой ПЦР. На анализ методом гнез

довой ПЦР потребовался один рабочий день, тогда как титрова

ние вируса НЭП на куриных эмбрионах заняло 14 дней.

Испытание разработанной тест-системы на эксперименталь

но зараженных эмбрионах проводили следующим образом.

1 0

144

Научная электронная библиотека ЦНСХБ