ЭлБиб

ления полиморфизма. Размер амплифицированных фрагментов опреде-

ляли в сравнении со стандартом — маркером длин 50 +

bp DNA Ladder

(«Евроген»).

Результаты и обсуждение

. Алгоритм исследований по иденти-

фикации образцов клевера лугового включал несколько необходимых

этапов работ: определение репрезентативной выборки растений, подго-

товка материала и оптимизация условий процедуры выделения ДНК;

подбор информативных SSR

маркеров для оценки полиморфизма; ана-

лиз полученных ПЦР

продуктов с целью выявления уникальных фраг-

ментов ДНК, характерных для отдельных изучаемых образцов.

Анализируемые образцы являлись популяциями, в этом случае

составление выборки — первый и наиболее важный этап при изучении

изменчивости. Как правило, выборка из 30–50 растений на сорт счита-

ется достаточной для обеспечения предварительной оценки различий

между сортами и внутрисортового разнообразия, если оценивается

большое количество независимых маркеров (например, 20–30 микроса-

теллитов). В случае перекрестноопыляемых видов (клевер луговой), ко-

торые характеризуются большой внутрипопуляционной генетической

изменчивостью, для учета редких аллелей, встречаемых с частотой 5 %,

необходимо брать для анализа не менее 100 растений [9]. Однако на

практике сложно проанализировать большое число индивидуальных ге-

нотипов от каждого сорта или популяции, так как это довольно дорого-

стоящий и трудоемкий процесс. Поэтому в большинстве работ по оцен-

ке генетической изменчивости в популяциях клевера лугового до на-

стоящего времени используется, как правило, от одного до 40 растений

[2; 10].

Эффективным подходом для генотипирования с наименьшими

усилиями в этом случае является балк

анализ (

bulked sergeants

analysis)

— метод, при котором для изучения генетической вариабель-

ности используется навеска растительной ткани из смеси отдельных об-

разцов в составе большого пула

[11; 12].

В ходе наших исследований при определении оптимального спо-

соба выделения ДНК провели ряд экспериментов в нескольких вариан-

тах. Формировали общую навеску из смеси проростков семян индиви-

дуальных генотипов или выделяли ДНК из отдельного проростка раз-

ных семян исследуемого образца. Варьировали размер выборки (коли-

чество проростков) и величину навески. Растительную ткань предвари-

тельно промораживали при температуре –

ºС или же использовали без

проморозки. Для ДНК

экстракции был выбран коммерческий набор

реагентов от компании «Синтол». Этот набор и ранее успешно исполь-

зовался нами при выделении ДНК из разных кормовых культур (люцер-

на, рапс, злаковые травы) и имеет ряд преимуществ. В частности, в ме-

тодике не используется жидкий азот, стадия гомогенизации достаточно

Электронная Научная СельскоХ

ать

озяйственная Библиотека