ЭлБиб

ки, что существенно ограничивает применение белковых маркеров,

а выявляемые различия не всегда типичны для большей части генома.

Последние достижения в молекулярной биологии создали условия

для развития технологии полимеразной цепной реакции, что позволило

выявлять полиморфизм на уровне ДНК. Анализ ДНК напрямую харак-

теризует геном, а не его фенотипические проявления, может дать устой-

чивые характеристики растения, нейтральные по отношению к среде

обитания и вполне пригодные для идентификации и различения геноти-

пов, паспортизации сортов и маркирования хозяйственно ценных генов

и признаков [5]. Эти маркеры устойчиво проявляются в различных ус-

ловиях и постепенно становятся предпочтительным инструментом при

изучении генетической изменчивости, в том числе в селекционной ра-

боте с клевером луговым [6; 7]. Однако к настоящему моменту все еще

не разработана эффективная и высокопроизводительная методика, ко-

торая позволила бы осуществлять генетическую идентификацию на

большом числе сортов и форм за короткие сроки, не опираться на мор-

фологические параметры растения и при этом была бы относительно

дешевой.

В связи с этим, цель наших исследований заключалась в отработ-

ке технологии генотипирования ДНК селекционного материала клевера

лугового на основе микросателлитного анализа для последующей сор-

товой идентификации и генетической паспортизации.

Материалы и методы исследований

. Объектом исследований

служили девять образцов клевера лугового разных регионов происхож-

дения, предоставленные лабораторией селекции клевера ФНЦ «ВИК

им. В. Р. Вильямса».

Выделение ДНК проводили из семидневных проростков скарифи-

цированных семян с использованием коммерческого набора реагентов

«ДНК

Экстран

4» от компании «Синтол» (Россия).

Для ПЦР

анализа выбрали семь микросателлитных (

SSR

) прайме-

ров:

RCS1640, RCS4280; RCS4982; RCS1303; RCS0131; RCS3711,

RCS

1307, по одному на каждую группу сцепления. Праймеры разрабо-

таны для структурного анализа генома клевера лугового [8] и синтези-

рованы в компании «Евроген» (Россия). Реагенты для смеси ПЦР полу-

чены от «СибЭнзим» (Россия). Амплификация ДНК проходила в термо-

циклере

BIO-RAD

(США) и включала предварительную денатурацию

цепочек ДНК (три минуты при 94 ºС); затем 45 циклов гибридизации

праймеров (с поэтапным уменьшением температуры отжига от 68 ºС до

ºС) и заключительную элонгацию цепи ДНК (10 минут при 72 ºС).

Продукты амплификации разделяли методом электрофореза в 4

ном агарозном геле (

MetaPhor

Agarose

), документировали с помощью

системы «

Cleaver Scientific LtD UV

» и анализировали на предмет выяв-

Электронная Н учная СельскоХ

озя ственная Библиотека