ЭлБиб

Ñàäîâîäñòâî è âèíîãðàäàðñòâî, ¹ 6, 2015

БИОТЕХНОЛОГИЯ

для прогнозирования эффективности опыле-

ния сортов черешни. Исходя из этого были по-

ставлены следующие задачи:

1. Выполнить идентификацию аллелей гена

самонесовместимости черешни среди образцов

генетических ресурсов отечественной генплазмы.

2. Провести фенотипическую оценку со-

вместимости при опылении некоторых сортов

черешни селекции СКЗНИИСиВ с установлен-

ным аллельным набором

-гена.

Методы

Объектами исследования послужили 5 сортов

черешни отечественной селекции, представлен-

ные в генетической коллекции СКЗНИИСиВ.

Для проверки достоверности полученных дан-

ных были взяты сорта мировой селекции Фран-

цис, Ван и Стелла с установленными аллелями.

Молекулярно-генетический анализ поли-

морфизма S-гена черешни проводили с исполь-

зованием консенсусных и аллель-специфич-

ных ДНК-маркеров [5, 6].

Экстракцию ДНК проводили с использо-

ванием метода ЦТАБ [3] с небольшими моди-

фикациями, заключающимися в наличии до-

полнительного переосаждения проб в солевом

буфере с последующей холодовой преципита-

цией ДНК в 96 % этаноле.

В состав ПЦР смеси входили: 40-50 нг ДНК,

0,05 мМ dNTPs, 0,3 мкM каждого праймера,

1 единица активности (е. а.) Taq-ДНК полиме-

разы для праймеров PaConsI и 1,25 е. а. Taq-

ДНК полимеразы для праймеров PaConsII,

в общем объеме реакционной смеси 25 мкл.

Использовали следующие программы ПЦР:

2 минуты при 94 °С – начальная денатурация;

следующие 35 циклов: 30 секунд при 94 °С –

денатурация; 1 минута при 55 °С (для PaConsI)

или 58 °С (для PaConsII) – отжиг праймеров;

45 секунд (для PaConsI) или 2 минуты (для

PaConsII) – элонгация при 72 °С; завершающий

цикл элонгации – 5 минут при 72 °С.

Электрофорез продуктов ПЦР проводили в

1,5 % агарозном геле при напряжении 150 V в

течение 40 минут. Гелевые пластины окраши-

вали бромистым этидием и визуализировали в

ультрафиолетовом свете.

Эксперименты по определению совмести-

мости сортов черешни проводились в усло-

виях Прикубанской зоны на базе 2 отд. ОПХ

«Центральное» (Краснодар). В опыте были за-

действованы деревья черешни 1995 г. посадки.

Участок без орошения. Учеты завязи от есте-

ственного и искусственного опыления прово-

дились 3 раза: 1-й через 15 дней после оконча-

ния цветения; 2-й после июньского осыпания

завязи; 3-й перед съемом урожая. В период

проведения опыления проверялась жизнеспо-

собность пыльцы путем проращивания в 10 %

растворе сахарозы во влажной камере.

Результаты

На начальном этапе идентификации аллелей

были использованы консенсусные праймер-

ные пары PaConsI и PaConsII, фланкирующие

гипервариабельные области первого и второго

интрона гена самонесовместимости, соответ-

ственно. На рис. 1 представлены результаты

электрофоретического анализа продуктов ПЦР

с данными праймерными парами.

1 2 3 4 5 М М 1 2 3 4 5 М

Рис. 1. Аллельный полиморфизма S-гена, выявляемый при анализе 1-го (А) и 2-го (Б) интрона (где М – маркер

молекулярной массы ДНК; сорта: А: 1 – Анонс; 2 – Крупноплодная; 3 – Кавказская; 4 – Краса Кубани;

5 – Василиса; Б: 1 – Краса Кубани; 2 – Кавказская; 3 – Василиса; 4 – Крупноплодная; 5 – Спутник)

А Б

Электронная Научная СельскоХоз йственная Библиотека