ЭлБиб

ðóþò ðàñùåïëåíèå äèïåïòèäîâ ñ N-è Ñ-êîíöà ïåï-

òèäíîé ñâÿçè äî íèçêîìîëåêóëÿðíûõ ïåïòèäîâ è ñâî-

áîäíûõ àìèíîêèñëîò.

Ïðîòåèíàçû (ÊÔ 3.4.21-24) êàòàëèçèðóþò ãèäðî-

ëèç ïåïòèäíûõ ñâÿçåé ïîëèïåïòèäíîé öåïè ñ îáðàçî-

âàíèåì ïåïòèäîâ ñ ðàçëè÷íîé ìîëåêóëÿðíîé ìàññîé:

ñåðèíîâûå (ÊÔ 3.4.21) — â êàòàëèòè÷åñêîì öåíòðå

íàõîäèòñÿ òðèàäà àìèíîêèñëîò: àñïèðàãèíîâàÿ, ãèñ-

òèäèí, ñåðèè;

òèîëîâûå (ÊÔ ÇÀ.22) — â àêòèâíîì öåíòðå íàõî-

äèòñÿ SH-ãðóïïà öèñòåèíà;

êèñëûå (ÊÔ 3.4.23) — â èõ êàòàëèòè÷åñêîì àêòå

ó÷àñòâóþò îñòàòêè äèêàðáîíîâûõ àìèíîêèñëîò, èìå-

þò îïòèìàëüíûé pH íèæå 5,0;

ìåòàëëîñîäåðæàùèå (ÊÔ 3.4.24) — ñîäåðæàò â àê-

òèâíîì öåíòðå èîíû ìåòàëëîâ, èíãèáèðóþòñÿ õèëàò-

íûìè ñîåäèíåíèÿìè.

Â ïèùåâîé ïðîìûøëåííîñòè èñïîëüçóþò ÔÏ

ïðîòåîëèòè÷åñêîãî äåéñòâèÿ ðàçëè÷íûõ ïðîèçâîäè-

òåëåé, ìåòîäû îïðåäåëåíèÿ àêòèâíîñòè êîòîðûõ ñó-

ùåñòâåííî îòëè÷àþòñÿ äðóã îò äðóãà. Â êà÷åñòâå ñóá-

ñòðàòîâ èñïîëüçóþò áåëêè ðàçëè÷íîãî ïðîèñõîæäå-

íèÿ; ðàçëè÷àþòñÿ òàêæå óñëîâèÿ ïðîâåäåíèÿ ôåð-

ìåíòàòèâíîé ðåàêöèè (òåìïåðàòóðà, pH, äëèòåëü-

íîñòü ãèäðîëèçà). Ïîýòîìó ïðîâåäåíèå ñðàâíèòåëü-

íîãî àíàëèçà ÔÏ-èñòî÷íèêîâ ïðîòåàç çíà÷èòåëüíî

çàòðóäíåíî.

Ïðîòåîëèòè÷åñêàÿ àêòèâíîñòü õàðàêòåðèçóåò îá-

ùóþ ñïîñîáíîñòü ïðîòåîëèòè÷åñêèõ ôåðìåíòîâ êà-

òàëèçèðîâàòü ðàñùåïëåíèå áåëêà äî ïåïòèäîâ è àìè-

íîêèñëîò è âûðàæàåòñÿ ÷èñëîì óñëîâíûõ åäèíèö.

Äëÿ õàðàêòåðèñòèêè ôåðìåíòíûõ ïðåïàðàòîâ è

îöåíêè èõ êà÷åñòâà ïðåäëàãàþòñÿ ðàçëè÷íûå ìåòîäû

îïðåäåëåíèÿ ïðîòåîëèòè÷åñêîé àêòèâíîñòè. Òàê, ñó-

ùåñòâóåò ìåòîä îïðåäåëåíèÿ ïðîòåîëèòè÷åñêîé àê-

òèâíîñòè ïî ÃÎÑÒ 20264.2–88, îñíîâàííûé íà ãèä-

ðîëèçå êàçåèíàòà íàòðèÿ èññëåäóåìûì ÔÏ äî ïåïòè-

äîâ è àìèíîêèñëîò ñ ïîñëåäóþùèì èõ îïðåäåëåíèåì

[2]. Â ýòîì ìåòîäå çà åäèíèöó ïðîòåîëèòè÷åñêîé àê-

òèâíîñòè ïðèíÿòà ñïîñîáíîñòü ôåðìåíòà ïðåâðàùàòü

çà 1 ìèí ïðè òåìïåðàòóðå 30 °Ñ êàçåèíàò íàòðèÿ â íå-

îñàæäàåìîå òðèõëîðóêñóñíîé êèñëîòîé ñîñòîÿíèå â

êîëè÷åñòâå, ñîîòâåòñòâóþùåì 1 ìêìîëü òèðîçèíà.

Ïðîòåîëèòè÷åñêóþ àêòèâíîñòü âûðàæàþò ÷èñëîì

óêàçàííûõ åäèíèö â 1 ã (ñì

) èñïûòóåìîãî ïðåïàðàòà.

Èçëîæåííûé â ÃÎÑÒå ìåòîä ïîçâîëÿåò îïðåäåëÿòü

îáùóþ ïðîòåîëèòè÷åñêóþ àêòèâíîñòü ìèêðîáíûõ

ïðîòåàç ïðè çíà÷åíèÿõ ðÍ â ñëåäóþùèõ äèàïàçîíàõ:

äëÿ êèñëûõ ïðîòåèíàç — 2,5±0,2 è 5,5±0,2;

äëÿ íåéòðàëüíûõ ïðîòåèíàç — 7,2±0,2;

äëÿ ùåëî÷íûõ ïðîòåèíàç — 9,5±0,2.

Îäíàêî â ðåçóëüòàòå àíàëèçà øèðîêîãî ìàññèâà

ýêñïåðèìåíòàëüíûõ, ñòàòèñòè÷åñêè îáîáùåííûõ

äàííûõ áûë âûÿâëåí âàæíûé íåäîñòàòîê ýòîãî ìåòî-

äà. Ïðè ïðèãîòîâëåíèè ñóáñòðàòà êàçåèíàò íàòðèÿ â

êèñëîé è ñëàáîêèñëîé çîíàõ pH ñâîðà÷èâàåòñÿ, îáðà-

çóÿ õëîïüÿ, ÷òî äåëàåò ýòîò ìåòîä íå óíèâåðñàëüíûì

äëÿ âñåõ îáëàñòåé pH è íå ïîçâîëÿåò ïîëó÷àòü äîñòî-

âåðíûå äàííûå îá óðîâíå ïðîòåîëèòè÷åñêîé àêòèâ-

íîñòè â ôåðìåíòíûõ ïðåïàðàòàõ.

Ñóùåñòâóåò òàêæå ìåòîä îïðåäåëåíèÿ ïðîòåîëèòè-

÷åñêîé àêòèâíîñòè â êèñëîé è ñëàáîêèñëîé çîíàõ pH,

îñíîâàííûé íà ãèäðîëèçå áåëêà ãåìîãëîáèíà ïðåïà-

ðàòîì ôåðìåíòà, íàõîäÿùåãîñÿ â èññëåäóåìîì ðàñ-

òâîðå, ñ ïîñëåäóþùåé èíàêòèâàöèåé ôåðìåíòà è

îñàæäåíèåì íåïðîãèäðîëèçîâàííîãî áåëêà òðèõëî-

ðóêñóñíîé êèñëîòîé [3].

Ïðîòåîëèòè÷åñêàÿ àêòèâíîñòü â äàííîì ìåòîäå õà-

ðàêòåðèçóåò ñïîñîáíîñòü ôåðìåíòîâ êàòàëèçèðîâàòü

ðàñùåïëåíèå áåëêà ãåìîãëîáèíà äî ïåïòèäîâ è àìè-

íîêèñëîò è âûðàæàåòñÿ ÷èñëîì åäèíèö ïðîòåàçû íà

1 ã ïðåïàðàòà. Çà åäèíèöó ïðîòåîëèòè÷åñêîé àêòèâ-

íîñòè (ÏÑ) ïðèíèìàþò òàêîå êîëè÷åñòâî ôåðìåíòà,

êîòîðîå çà 1 ìèí ïðè 30 °Ñ ïðåâðàùàåò ãåìîãëîáèí â

íåîñàæäàåìîå ñîñòîÿíèå òðèõëîðóêñóñíîé êèñëîòîé

â êîëè÷åñòâå, ñîîòâåòñòâóþùåì 1 ìêìîëü òèðîçèíà

(1 ìêìîëü òèðîçèíà ðàâåí 0,181 ìã); àêòèâíîñòü âû-

ðàæàåòñÿ â åä. ÏÑ/ã.

Îïðåäåëåíèå ïðîòåîëèòè÷åñêîé àêòèâíîñòè îñó-

ùåñòâëÿþò â çîíå pH 4,0–5,4. Â äàííîì ìåòîäå ãåìî-

ãëîáèí ðàñòâîðÿþò â àöåòàòíîì áóôåðå (0,2 Ì ðàñ-

òâîð ñîëÿíîé êèñëîòû è 0,2 Ì ðàñòâîð àöåòàòà íàòðèÿ

â ðàçëè÷íûõ ïðîïîðöèÿõ äëÿ ñîçäàíèÿ ðÍ áóôåðà îò

3,40 äî 4,95). Îäíàêî ïðè çíà÷åíèÿõ ðÍ ñâûøå 5,5 èñ-

ïîëüçîâàíèå äàííîãî áóôåðíîãî ðàñòâîðà íå ïîäõî-

äèò èç-çà ñíèæåíèÿ åãî áóôåðíûõ ñâîéñòâ. Ñóáñòðàò,

ïðèãîòîâëåííûé íà ýòîì áóôåðå ïðè pH 6,0 è áîëåå,

íåñòàáèëåí, ÷òî ñíèæàåò äîñòîâåðíîñòü ïîêàçàòåëåé

àêòèâíîñòè ÔÏ.

Òàêèì îáðàçîì, äàííûé ìåòîä òàêæå íå ÿâëÿåòñÿ

óíèâåðñàëüíûì â ñâÿçè ñ òåì, ÷òî îí ðàññ÷èòàí òîëü-

êî íà ñëàáîêèñëóþ çîíó pH. Äðóãîé íåäîñòàòîê ýòîãî

ìåòîäà çàêëþ÷àåòñÿ â òîì, ÷òî ñóáñòðàò ãîòîâÿò ðàç-

âåäåíèåì íàâåñêè ãåìîãëîáèíà (2,2 ã) â 100 ñì

áóôå-

ðà, äîáàâëÿÿ çàòåì 36 ã ìî÷åâèíû. Ïðèãîòîâëåííûé

òàêèì îáðàçîì ðàñòâîð ñóáñòðàòà íåñòðîãî ñîîòâåò-

ñòâóåò êîíöåíòðàöèè ãåìîãëîáèíà 2 %.

Ïðè ðàçðàáîòêå òåõíîëîãèé ïðèìåíåíèÿ ÔÏ â ïè-

ùåâîé ïðîìûøëåííîñòè ñ öåëüþ áèîêàòàëèçà áåëêî-

âûõ ïîëèìåðîâ ïåðåðàáàòûâàåìîãî ñûðüÿ íåðåäêî

âîçíèêàåò íåîáõîäèìîñòü èññëåäîâàòü àêòèâíîñòü

ÔÏ, ïðîÿâëÿåìóþ âî âñåõ çîíàõ pH. Îñîáåííî ýòî

âàæíî ïðè îïðåäåëåíèè ýôôåêòèâíîñòè ïðèìåíåíèÿ

áèîêàòàëèçàòîðîâ â ðàçëè÷íûõ îòðàñëÿõ ïðîìûø-

ëåííîñòè. Â ñïèðòîâîì ïðîèçâîäñòâå âàæíà îáëàñòü

pH îò 4,0 äî 6,5; â ìîëî÷íîé ïðîìûøëåííîñòè — îò

3,5 äî 5,5; â ñîêîìîðñîâîé — îò 3,0 äî 4,5; â ñèíòåòè-

÷åñêèõ ìîþùèõ ñðåäñòâàõ — îò 6,0 äî 9,0.

Ïîýòîìó â çàäà÷ó äàííûõ èññëåäîâàíèé âõîäèëà

ðàçðàáîòêà óíèâåðñàëüíîãî ìåòîäà îïðåäåëåíèÿ îá-

ùåé ïðîòåîëèòè÷åñêîé àêòèâíîñòè ôåðìåíòíûõ ïðå-

ïàðàòîâ ïðè ðàçëè÷íûõ çíà÷åíèÿõ ðÍ. Îñíîâíûì

ñóáñòðàòîì áûë âûáðàí ãåìîãëîáèí, òàê êàê îí äîñòà-

òî÷íî õîðîøî ðàñòâîðèì âî âñåõ äèàïàçîíàõ ðÍ óíè-

âåðñàëüíîãî áóôåðà. Êðîìå òîãî, áûëî óñòàíîâëåíî,

÷òî ãåìîãëîáèí íå ñâîðà÷èâàåòñÿ â óíèâåðñàëüíîì

áóôåðå â êèñëîé çîíå ðÍ, êîòîðûé ïðèìåíÿëè äëÿ

ïðèãîòîâëåíèÿ ñóáñòðàòà, èñïîëüçóÿ êàçåèíàò íàòðèÿ.

Äëÿ ïðèãîòîâëåíèÿ óíèâåðñàëüíîãî áóôåðà áûëè

èñïîëüçîâàíû ðàñòâîðû óêñóñíîé, îðòîôîñôîðíîé è

ХРАНЕНИЕ И ПЕРЕРАБОТКА СЕЛЬХОЗСЫРЬЯ, № 6, 2010

Электронная Научная СельскоХозяйственная Библиотека