Table of Contents Table of Contents
Previous Page  172 / 604 Next Page
Information
Show Menu
Previous Page 172 / 604 Next Page
Page Background

Целью данного исследования являлась разработка оптимальных

способов культивирования и очистки аденовируса свиней.

На первом этапе была проведена отработка способа культи­

вирования аденовируса в монослойных культурах клеток. В опы­

тах использовали адаптированный к первичной культуре клеток

свиной почки (СП) штамм аденовируса свиней, хранившийся в

музее ВНИИ защиты животных.

Лиофильно высушенный вирус растворяли в среде Игла и

высевали на культуру клеток СП. Культивирование проводили в

среде Игла с 1-2% инактивированной сыворотки КРС. На пер­

вом пассаже через 96 часов культивирования ЦПД не наблюда­

ли, однако на втором пассаже через 90 часов более 95% клеток

имели характерные синцитиальные образования, и на последую­

щих пассажах через 72 часа наблюдали полную деструкцию кле­

ток и отделение их от стекла. Титр инфекционности с 2-го по 9-й

пассаж вырос от 5,5 до

6

,5 -7

,0

lg ТЦЦ

5 0

/мл. Титр вируса суще­

ственно не изменялся при множественности заражения от

0 ,1

до

1,0 И.Е./клетку.

С целью поиска наиболее чувствительных к AVS клеток

свиного происхождения были испытаны следующие перевивае­

мые культуры: РК-15, СПЭВ, "А

4

х С

2

(СПЭВ х спленоциты

свиней) и SP-12. Для заражения использовали вирус

6

-го пасса­

жа на СП с титром инфекционности 6,0 lg ТЦД

5 0

/МЛ. Культиви­

рование проводили в бессывороточной среде.

Характерные цитопатологические изменения наблюдали на

культуре клеток РК-15 уже на первом пассаже через 120 часов.

На СПЭВ через 140 часов культивирования изменения были ме­

нее выражены, на SP-12 они проявились только на втором пас­

саже через 96 часов, а на "А

4

х С

2

'* на протяжении 3 пассажей

ЦПД не наблюдали.

Получение высокоочищенного аденовируса свиней ослож­

нено тем, что значительная часть вирионов связана с клеточны­

ми структурами и при гомогенизации в растворах без детерген­

тов не отделяется от клеток. Для поиска оптимального способа

очистки AVS нами были использованы Triton Х-100 и Tween-

2 0

.

К двум образцам по 50 мл вируссодержащей суспензии с

титром 5,0 ig ТЦД

50

/МЛ, добавляли Triton Х-100 или Tween-20

до 0,2% и, затем, центрифугировали при 3000 об/мин 5 минут.

Собирали надосадочную жидкость, а соответствующие образцы

осадков клеток гомогенизировали в объемах по 50 мл фосфатно­

буферного физиологического раствора с pH 7,4 (ЗФР) с

0

,

2

%

Triton Х-100 или Tween-20. Затем суспензии клеток центрифуги­

168

Научная электронная библиотека ЦНСХБ