ЭлБиб

гемагглютинин-эстеразы (НЕ), по которому имеется наибольшее

количество данных, т.к. он кодирует белок, вызывающий образо

вание вируснейтрализующих АТ, а изучению структурно-функцио

нальных особенностей таких белков традиционно уделяется

большое внимание. Для сравнительного анализа использовали

опубликованные последовательности НЕ гена 7 штаммов КВ КРС,

выделенных в Америке и Канаде. Данный анализ позволил вы

явить консервативные области гена, пригодные для гибридизации

с праймерами.

Расчет первичной структуры праймеров проводили с помо

щью программы Oligo, версия 3.3. Несмотря на большую протя

женность консервативных участков НЕ гена, выбор праймеров

был осложнен низкой температурой отжига олигонуклеотидов

вследствие большого количества А и Т нуклеотидов. Увеличение

длины олигонуклеотидов с целью повышения температуры их

отжига лимитировалось резким повышением свободной энергии

самокомплементарных структур. Было синтезировано 3 поямые,

комплементарные положительной цепи РНК (вирионной), и 5

обратных, комплементарных отрицательной цепи РНК, прайме

ров, которые в большей степени отвечали предъявляемым требо

ваниям. Их эффективность была проверена в ПЦР с использова

нием в качестве мишени РНК штамма Nebraska. Для синтеза

кДНК провели две реакции обратной транскрипции (ОТ), в каж

дой из которых использовали по одному прямому праймеру СН4

и СН4а. Каждый из продуктов реакции ОТ с соответствующим

ему прямым праймером в паре с каждым из четырех обратных

праймеров использовали для постановки реакции амплификации.

Анализ продуктов амплификации показал, что в обеих реакциях

с праймером СН

с синтезировались два неспецифических про

дукта реакции, которые по количеству не уступали специфиче

скому продукту и были близки по размеру. В других реакциях

неспецифических продуктов не было выявлено, но они отличались

по концентрации специфического продукта. Максимальная кон

центрация специфического фрагмента кДНК наблюдалась в ре

акции с праймерами CHlb - СН4. Поэтому в дальнейшей работе

использовали только эту пару праймеров. Праймеры СН2 и СНЗ,

по своей локализации на геноме более подходящие для «nested»

ПЦР, также эффективно выявляли присутствие вирусспецифиче-

ской кДНК после первой реакции амплификации без образова

ния неспецифических продуктов. Специфичность реакции была

подтверждена секвенированием амплифицированного фрагмента.

Оптимальная температура отжига праймеров CHlb и СН4

составляет 59°С, праймеров СН2 и СНЗ - 60°С. В этих условиях

достигался высокий выход продуктов реакции без снижения ее

специфичности.

134

Научная электронная библиотека ЦНСХБ