21
культур является создание исходного материала,
устойчивого к патогенам. Поиск генетических ис-
точников и доноров устойчивости и разработка на
их основе устойчивых сортов является важной
задачей селекционных подразделений.
Новые возможности в развитии этого направ-
ления открылись с появлением методов маркер-
вспомогательной селекции, основанных на ис-
пользовании ДНК-маркеров, тесно сцепленных с
генами хозяйственно-ценных признаков. Исполь-
зование ДНК-маркеров при селекции на устойчи-
вость к болезням позволяет интенсифицировать
отбор растений, устойчивых к разрушительному
действию патогенов, а также существенно сокра-
тить временные и финансовые затраты [2; 3].
В настоящее время большой интерес для прак-
тической селекции представляет технология гено-
типирования на основе анализа полиморфизма
микросателлитов, так называемый SSR-анализ.
Гипервариабельность микросателлитных последо-
вательностей и равномерность распределения их
по геному в сочетании с простотой обнаружения,
а также высокая воспроизводимость результатов
делает микросателлиты незаменимым инстру-
ментом для выявления внутрипопуляционного
пула ДНК-полиморфизма, детекции генов количе-
ственных признаков и построения генетических
карт [4; 5].
На основе микросателлитных маркеров была
разработана насыщенная генетическая карта кле-
вера лугового [6; 7]. В совместном проекте ВНИИ
кормов им. В.Р. Вильямса и Хоккайдского центра
сельскохозяйственных исследований (Япония) на
протяжении нескольких лет проводятся исследо-
вания по ДНК-маркированию селекционно-цен-
ных признаков и свойств этой важной кормовой
культуры.
Цель настоящего исследования заключалась в
изучении возможности создания универсального
набора микросателлитных праймеров для анали-
за популяций клевера лугового, использования
их в селекции на зимостойкость и устойчивость
к склеротиниозу в условиях Нечерноземной зоны
России и выделение генетических источников
устойчивости к этой болезни.
Материал и методы исследований
Объектом исследования служила эксперимен-
тальная популяция клевера лугового ГР (гибрид-
ная ранняя), которая была получена в отделе ге-
нофонда ВНИИ кормов им. В.Р. Вильямса путем
скрещивания генотипов популяции HRxR130
[7; 8], прошедших предварительную двухлетнюю
оценку на склеротиниозном провокационном
фоне с повышенной инфекционной нагрузкой.
В качестве родительских форм для создания
родственной популяции были отобраны генотипы
с альтернативным проявлением признаков – F113
и F141. Материнское растение F113 – раннецве-
тущее, с высокой восприимчивостью к возбуди-
телю клеверного рака, F141 – отцовская форма,
позднецветущая, с относительной устойчивостью
к болезни. Искусственное опыление проводили
в условиях теплицы с использованием методиче-
ских разработок ВНИИ кормов [9; 10].
Семена, полученные от скрещивания, высе-
яли в пластиковые стаканчики и выращивали в
теплице до трех настоящих листьев. Затем расте-
ния были высажены в поле на искусственном ин-
фекционном фоне иммунологического питомника
ВНИИ кормов для изучения устойчивости к скле-
ротиниозу и отбора перспективных генотипов.
Растения размещали индивидуально 25х45 см. В
качестве контроля использовали сорт-стандарт
ВИК-7. В общей сложности было высажено 122 ге-
нотипа. Основные учеты пораженности проводи-
ли в течение второго и третьего годов жизни рас-
тений, согласно методическим указаниям ВНИИ
кормов [10; 11]. После первой и второй перезимо-
вок, весной 2008 и 2009 гг., регистрировали выпав-
шие и оценивали степень поражения выживших
растений с использованием модифицированной
шкалы, разработанной во ВНИИ кормов [11].
В сентябре, накануне первой зимовки, из мо-
лодых свежесобранных листьев растений была
выделена геномная ДНК с помощью коммерческо-
го набора DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Нидер-
ланды), по инструкции изготовителя.
Для амплификации использовали набор SSR-
праймеров с известной последовательностью ну-
клеотидов, которые были разработаны в институ-
те ДНК-исследований (Казуса, Япония) [8].
Полимеразную цепную реакцию проводили в
объеме 15 µl, содержащем 1х реакционный буфер
и 2,5 ед. рекомбинантной Tag-полимеразы компа-
Электронная Научная Сельск Хозяйственная Библиотека