263 / 318
252
ГЕНЕТИКО-СЕЛЕКЦИОННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Результаты и обсуждение
Первым этапом работы при использовании молекулярных методов иссле
дованияДНК растений, является получение высокоочищенной геномнойДНК
из различных растительных тканей. Несмотря на существование ряда опубли
кованных протоколов по выделению тотальной ДНК растений, при работе со
сложными для исследования древесными культурами, к которым относится и
сирень, необходима модификация этих методик. Это связано с наличием в
клетках этих растений большого количества вторичных метаболитов, в том
числе эндогенных полисахаридов и фенольных соединений, которые трудно
отделить от ДНК. Образцы ДНК, полученные нами по нескольким стандарт
ным методикам [4, 5] содержали большое количество примесей и не могли
быть использованыдля дальнейшего RAPD-анализа. Модификация протокола
выделения тотальной растительнойДНК с помощью СТАВ-буфера, позволила
получить высококачественную тотальнуюДНК сирени. В результате данного
этапа работы также установлено, что наиболее подходящим растительным ма
териалом являются молодые, активно растущие побеги и-листья.
Следующий этап работы состоял в оптимизации RAPD-метода и иден
тификации праймеров, которые обнаруживают полиморфизм применительно
к отобранным видам и сортам коллекции сирени. Испытано 10 произволь
ных десятичленных праймеров, различающихся по нуклеотидной последова
тельности и GC составу (табл. 1). Проведенное электрофоретическое фрак
ционирование продуктов полимеразной цепной реакций препаратов ДНК с
этими произвольными десятичленными праймерами (RAPD) позволило вы
явить широкий спектр амплимерных зон. Следует отметить, что из 10 ис
пользованных праймеров, полиморфные спектры были получены по
6
из
них для изучаемых образцов ДНК сирени. Анализ по данным праймерам у
исследованных образцов обнаружил амплимерные зоны, 29 из которых были
полиморфны. На основании полученных RAPD-спекгров для всех исследо
ванных сортов сирени были составлены многолокусные RAPD-паспорта (табл.
2
). Следует отметить, что в табл. 2 приведены только те амплимерные зоны,
электрофоретическая идентификация которых была наглядна и легка, а гене
тическая детерминация не вызывала никаких сомнений. Для количественной
оценки RAPD полиморфизма и определения уровня дивергенции между ис
следуемыми сортами сирени полученные результаты были представлены в
виде матрицы состояний бинарных признаков, где присутствие фрагмента
принималось за 1, отсутствие —за 0. Величина размера каждой амплифици-
рованной зоны вычислялась относительно электрофоретической подвижнос
ти маркеров с известной молекулярной массой. Обозначение зон производи
лось по названию праймера, использованного для полимеразной цепной ре
акции, и размера зоны (в парах нуклеотидов) в надстрочнике. Так, напри
мер, зона размером в 2723 п.н. в-электрофоретическом спектре продуктов
ПЦР с праймером Oligol
6
(Рис.
1
) была обозначена —
01
igol
6
2723. Показано,
что популяции различаются по генетической вариабельности их представите
лей, которая выражалась не только в наличии полиморфных локусов в ДНК
некоторых растений, но и в варьировании интенсивности гомологичных фраг
ментов в профилях амплификации ДНК у разных растений (Рис.
1
).
Проведенная работа позволила перевести исследования растений сире
ни на качественно новый уровень, систематизировать по ряду биохимичес
ких показателей. В результате проведенных исследований отработан метод
выделения высокоочищенной геномной ДНК из листьев сирени, подобра
ны эффективные праймеры и оптимизированы условия проведения ПЦР,
адаптирован метод RAPD-анализа для паспортизации сирени.
В заключении следует отметить, что коллекция сиреней ЦБС НАН
Электр нная Научная Се ьскоХозяйс венная Библиотека