ЭлБиб

Нами были использованы несколько

типов маркеров SCAR - маркеры (сик-

венсспецифические), позволяющие опре

делить наличие или отсутствие локуса у

исследуемого сорта, RAPD-маркеры, ис

пользование которых позволяет выявить

полиморфизм в структуре ДНК конкрет

ных геномов и соответственно составлять

их паспорта.

Однако в некоторых случаях работа с

SCAR-маркерами усложняется наличием

нескольких близких по нуклеотидному

составу аллелей, иногда различающихся

всего по 2 нуклеотидам. В данном случае

стандартный электрофорез в агарозном

геле не дает желаемого результата. В та

ком случае предлагается использовать по

лиакриламидные гели. RAPD-маркеры

позволяют использовать стандартный

электрофорез в более плотных гелях и

показывают более достоверный резуль

тат. Однако, как в первом случае, так и во

втором, для каждого маркера необходимо

проводить подбор условий проведения

ПЦР-реакции. Как экспериментально бы

ло показано на практике температура от

жига праймера, которую выдает олиго

калькулятор зачастую оказывается зани

женной, и в результате мы имеем слиш

ком много не полиморфных фрагментов в

геле, которые к тому же плохо разделя

ются. Нами выявлено, что повышение

температуры отжига увеличивает инфор

мативность и объективность такого ана

лиза. Это в свою очередь доказывает воз

можность более эффективного использо

вания данной технологии в наших усло

виях. Необходимо отметить, что в на

стоящее время существуют новые техно

логии, позволяющие проводить анализ с

точностью практически в 100% как по

наличию определенных локусов, так и

полиморфизма ДНК. Таких результатов

можно добиваться, используя специаль

ные приборы типа биоанализатора

Agilent 2100, секвенаторов и т.д. Эти осо

бенности

молекулярно-генетического

маркирования будут учтены в последую

щей оценке разных видов признаковой

коллекции люпина БГУ.

На данном этапе в наших исследова

ниях предусматривались следующие за

дачи:

1) отработка методов молекулярно-ге

нетического маркирования применитель

но к культуре люпина;

2) идентификация отдельных образ

цов люпина узколистного и белого по от

дельным маркерам ДНК для установле

ния наличия их в геномах изучаемых об

разцов.

Материалы для исследования были

взяты из коллекции люпина сектора гене

тики растений НИЛ молекулярной гене

тики и биотехнологии Белорусского госу

дарственного университета. Молекуляр

ные исследования проводили согласно

методическим указаниям [1].

Для выделения ДНК использовали

трех-, четырехдневные проростки люпи

на. Выделение и очистку ДНК исследуе

мых образцов проводили по методике

фирмы Fermentas, набором Genomic DNA

Purification Kit, разработанным этой же

фирмой. Пробы разводили бидистилиро-

ванной водой и хранили при -20° С. Кон

центрацию полученного раствора ДНК

определяли методом спектрофотометрии

на приборе CARY 50 SCAN (Varian, Ав

стралия). Для проведения PCR использо

вали амплификатор Thermo Hybaid Rx2

(Великобритания). Применяли ферменты и

реактивы фирмы «Fermentas» (Литва).

Используемые ISSR-праймеры были син

тезированы фирмой «Primetech» (Минск).

В работе использовали праймеры [ука

занные в литературе 2]:

AnManMl

(свя

зан с Rcl -геном, определяющим устой

чивость люпина к антракнозу),

Pauper

(связан с alc-геном, контролирующим

алкалоидность люпина),

LeMl

(связан с

1е-геном, уменьшающим растрескивае-

мость бобов),

МоА

(связан с mollis-

геном,

контролирующим

твердока

менность семян люпина),

KuHMl

(связан

с Ku-геном, уменьшающим потребность в

яровизации).

Продукты ПЦР разделяли методом

электрофореза в 2% агарозном геле с бу

фером ТАЕ в присутствии бромистого

117

Научная электронная библиот ка ЦНСХБ