ЭлБиб

несвязавшихся с полистиролом молекул анионной пероксидазы

лунки трижды промывали фосфатным буфером с добавлением 0,05

% твин 20 (ФТ). В промытые лунки приливали ФТ, содержащий

0,2 % овальбумин (ФТО), аликвоты цитоплазматической,

апопластной фракций или стандартные разведения анионной

пероксидазы, и сыворотку к ней, разведенную в ФТО. Смесь

инкубировали при 37° С в течение 1 ч, затем планшет промывали.

Количественную оценку сорбированных на планшете антител к

анионной пероксидазе определяли путем добавления в лунки

разведенных в ФТО, меченных пероксидазой кроличьих антител

(ИЭМ им. Гамалеи, Москва). Планшеты выдерживали I ч при 37°

С, после промывки, в лунки добавляли субстрат для оценки

пероксидазной активности, содержащий ортофенилендиамин (0,05

%), перекись водорода (0,01 %) в 0,05 М фосфатном буфере, pH

6,0. Развитие окраски останавливали добавлением 4 N H

Интенсивность хромофорного ответа, обратно пропорциональную

количеству анионной пероксидазы в анализируемом образце,

определяли на приборе '‘Фотометр” (Россия) при 490 нм.

Содержание анионной пероксидазы в экстрактах расчитывали по

калибровочной кривой оптической плотности ее стандартных

растворов с использованием компьютерных программ. Количество

белка оценивали согласно методу Bradford ( 1976).

Работу проводили на каллусах мягкой пшеницы

Triricum

aestivum

сорта Жница. Каллусы выращивали при 26° С в темноте,

на среде Мурасиге и Скуга (МС), в присутствии или отсутствии

низкомолекулярных производных хитина - хитоолигосахаридов

(ХОС) различной концентрации (от 0,01 до 100 мг/л), обладающих

элиситорной активностью (Тютерев, 2002). Часть каллусов спустя

5 сут после пересадки на среду с ХОС инфицировали спорами

возбудителя

твердой

головни.

Контролем

служили

необработанные ХОС и неинокулированные каллусы. Каллусы

фиксировали в жидком азоте через 3,

1 0

дней после

инфицирования.

Для

выделения

пероксидазы

каллусы

гомогенизировали в 0,01 М фосфатном буфере (ФБ), pH 6,0 (1:3),

фермент

экстрагировали

на

холоду.

Экстракт

центрифугировали 15 мин при 14000 об/мин, в надосадке методом

ИФА

оценивали

содержание

анионной

пероксидазы

(цитоплазматическая фракция). Из культуральной агаровой среды

429

Научная электронная библиотека ЦНСХБ