46 / 604
точной суспензии (lg7-8,5 ТЦД50/мл) добавляли NaCl до 0,15
М /л и 7,5% ПЭГа (М8000), центрифугировали при 18 000 g 25
минут. Осадок растворяли в 50 мл STE с добавлением 30% фреона
113 и центрифугировали при 11 000 g 15 минут. Полученный осадок
реэкстрагировали дважды с добавлением 10% фреона и 50 мл STE.
Центрифугирование проводилось в тех же режимах. Надосадки объ
единялись и центрифугировались при
1 0 0
0 0 0
g
1
час через слой
30%-ного раствора сахарозы, составляющей 15% объема про
бирки. Осадки ресуспендировались в 10 мл STE и наносились по
5 мл на градиент (15 мл раствора CsCl (1,37 г/мл), 15 мл 10%-
ного раствора сахарозы; градиент готовился за сутки до центри
фугирования). Центрифугирование проводилось при 100 000 g 5
часов. Вируссодержащая фракция определялась с помощью спек
трофотометра UVICORD - II (LKB, Швеция) при длине волны
254 нм и собиралась для последующего диализа в 3 л STE в те
чение 16-18 часов при 4 °С. После диализа вирус осаждался
(100
0 0 0
g 1,5 часа) и ресуспендировался в 1-2 мл STE с добав
лением
0
,
0 1
% азида натрия.
Концентрация вирусного белка, определенная с применени
ем спектрофотометра SPD -
6
AV (Shimadzu corporation, Япо
ния), составила 3 -5 мг/мл.
Контроль чистоты полученного препарата с помощью элек
тронного микроскопа (Jeol, Япония) показал отсутствие посто
ронних корпускулярных примесей в суспензии. Высокая чистота
вирусной суспензии установлена электрофорезом вирусных нук
леиновых кислот и белков в SDS-PAAG'e по Lammly. Высокая
специфичность препарата установлена с помощью ИФА.
Полученый описанными методами вирусный концентрат ис
пользовался в реакциях РДП, ИФА, иммуноэлектрофореза, ме
тодах изучения генома (электрофорез сегментов двухцепочной
РНК в 7% ПААГе) и белков реовируса (электрофорез белков в
10% ДСН-ПААГе по Lammiy).
44
Научная электронная библиотека ЦНСХБ