NED373392NED

106 Труды Федерального центра охраны здоровья животных. Том X Непрямой вариант ИФА. Метод последовательных разве- дений сывороток крови в ИФА проводили по общепринятой схеме с небольшими модификациями. Рекомбинантный белок (концентрация 0,78 мкг/мл) адсорбировали на 96-луночные по- листироловые планшеты фирмы «Nunc» (Дания) в 0,05 М кар- бонатно-бикарбонатном буфере (рН 9,6) по 100 мкл на лунку. Планшеты инкубировали в течение 16–18 ч при 4 ºС. Затем от- мывали 3 раза буфером PBST (на 1 л раствора: NaCl – 8,0 г; KCl – 0,2 г; Na 2 HPO 4 – 2,8 г; K 2 HPO 4 – 0,2 г; Tween-20 – 0,05 %; рН 7,3). Лунки планшетов блокировали 10 % раствором молока в PBST, который вносили по 100 мкл в каждую, и инкубировали 1 ч при 37 ºС. Планшеты отмывали трехкратно раствором PBST. Методом последовательных двукратных разведений одновре- менно с исследуемой сывороткой крови наносили отрицатель- ную и положительную контрольные сыворотки, начиная с раз- ведения 1:20. Инкубировали планшеты в термостатируемом шейкере 1 ч при 37 ºС. Повторяли отмывку планшетов. Затем вносили также по 100 мкл на лунку антивидовой конъюгат (Sigma, США) в рабочем разведении и инкубировали планшеты в аналогичных условиях. После отмывки добавляли субстрат ABTS в том же объеме. Реакцию останавливали через 10- 15 минут добавлением 1 % раствора додецилсульфата натрия. Учет результатов производили на спектрофотометре «SPECTRA SHELL» (Австрия) при длине волны 405 нм. Таким образом, методом последовательных двукратных разведений сывороток крови в ИФА определяли титр антител в пробах. Титром иссле- дуемой сыворотки считали последнее ее разведение, в котором значение оптической плотности (ОП) вдвое превышало среднее значение оптической плотности отрицательного контроля. Непрямой вариант ИФА для выявления антител к патоген- ным лептоспирам по одному разведению сывороток крови про- водили по вышеприведенной схеме, но исследуемые и кон- трольные сыворотки вносили в буфере в разведении 1:20. Методом одного разведения в ИФА определяли значение процента позитивности (ПП) по формуле: (ОП пробы – ОП К - ) / (ОП К + – ОП К - ) × 100 % , где ОП пробы – оптическая плотность исследуемой сыворотки; Электронная Научная СельскоХозяйственная Библиотека