NED373392NED

Болезни сельскохозяйственных животных 105 Выделение бактериальной ДНК осуществляли с использо- ванием 6 М гуанидинтиоцианата и стекловолокнистых филь- тров GF/F. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) . Для проведения ПЦР собирали реакционную смесь, которая содержала 5 мкл 10× бу- фера для Taq-полимеразы, 3 мМ Mg 2+ , 0,2 мМ dNTPs, 2 ед. Taq- ДНК-полимеразы, по 20 пмоль праймеров, 5 мкл раствора ДНК L. interrogans и воду до конечного объема 50 мкл. Реакцию про- водили на ДНК-амплификаторе Mastercycler (Eppendorf, Герма- ния). Программа включала 35 циклов ПЦР при следующем тем- пературном режиме: 30 сек денатурации при 94 ºС, 30 сек отжи- га праймеров при 55 ºС и 40 сек элонгации при 72 ºС. Продукты реакции анализировали с помощью электрофореза в 2,0 % ага- розном геле, содержащем 0,001 % бромистого этидия, при силе тока 50 мА. Молекулярное клонирование гена OmpL1 L. interrogans осуществляли по общепринятым методикам [2]. Экспрессия рекомбинантного белка. Культивирование Е. coli проводили в орбитальном шейкере при 150 об/мин и 37 ºС. В дневную культуру клеток, достигшую логарифмической фазы ро- ста, добавляли индуктор IPTG (Promega, США). Уровень экспрес- сии и размер рекомбинантного белка определяли с помощью элек- трофореза в 12 % полиакриламидном геле (ПААГе). Сыворотки крови свиней . В качестве положительного кон- троля в ИФА использовали сыворотку крови свиньи, привитой вакциной «Фарошур Голд В» производства фирмы Пфайзер, отобранную на 21 сут. после второй вакцинации. В качестве отрицательного контроля использовали нор- мальную сыворотку, полученную от здорового животного, не имеющего антител к патогенным лептоспирам. Для определения аналитической специфичности ИФА ис- пользовали сыворотки крови от свиней, имеющих антитела к Pasteurella multocida , Haemophillus parasuis , сальмонеллам, а также к вирусам репродуктивно-респираторного синдрома сви- ней и цирковирусу свиней 2 типа. Для определения диагностической чувствительности мето- да применяли сыворотки крови от свиней, привитых вакциной против лептоспироза. Электронная Научная СельскоХозяйственная Библиотека