ЭлБиб

ХРАНЕНИЕ и ПЕРЕРАБОТКА СЕЛЬХОЗСЫРЬЯ • № 11 • 2015

ведение

. Выделение генетического материала

из клеток млекопитающих, культур клеток и

бактерий — хорошо известные и отработан-

ные процедуры, по большей части не представля-

ющие трудностей, хотя и содержащие некоторые

технические нюансы. Однако выделение нуклеи-

новых кислот из клеток грамположительных бак-

терий, дрожжей и мицелиальных грибов сопряжено

с рядом трудностей, что объясняется наличием у

них прочной клеточной стенки, состоящей не толь-

ко из липидов, но и нерастворимых биополимеров,

таких как хитин и целлюлоза у мицелиальных гри-

бов, пептидогликаны у грамположительных бакте-

рий. Это во многом объясняет затруднения, возни-

кающие при попытках разрушения клеток грибов

и последующего выделения нуклеиновых кислот по

протоколам, составленным для животных клеток.

Также одно из серьезнейших препятствий на пути

выделения ДНК и различных фракций рибонукле-

иновых кислот (РНК) — мощная система внутрик-

леточных экзо- и эндонуклеаз, которые расщепля-

ют цепи нуклеиновых кислот на фрагменты,

использовать которые в последующих процедурах

обратной транскрипции не представляется возмож-

ным. В последнее время наметилась тенденция к

созданию готовых наборов для выделения генети-

ческого материала из разнообразных источников,

но, к сожалению, с помощью таких наборов не

всегда удается достичь удовлетворительных резуль-

татов, поэтому каждый исследователь вынужден

самостоятельно подбирать методику как разруше-

ния клеток, так и выделения нуклеиновых кислот

для каждого конкретного биообъекта.

Цель работы — создание эффективной методики

выделения из мицелия гриба

Aspergillus niger

РНК,

по критериям чистоты и качества пригодных для

дальнейших молекулярно-биологических манипу-

ляций, а именно: синтез кДНК в ходе реакции

обратной транскрипции, постановка полимираж-

ных цепных реакций (ПЦР) как на кДНК, так и

напрямую на РНК-матрице, оценка профилей экс-

прессии тех или иных генов.

Материалы и методы.

Культивирование штамма

Культивирование селекционного штамма Л-4 мице-

лиального гриба

A. niger

осуществляли в качалоч-

ных колбах на сахарозоминеральной среде на шей-

кере-инкубаторе Multitron (INFORS, Швейцария).

Эффективное кислотообразование обеспечивали

поддержанием режима ферментации штамма Л-4:

рН исходной питательной среды 5,5–6,5; возраст

посевного мицелия 42–48 ч, скорость перемеши-

вания культуральной жидкости 200 мин

–1

, темпе-

ратура 30±2 °С.

Состав сахарозоминеральной питательной среды

был оптимизирован для сверхсинтеза лимонной

кислоты штаммом-продуцентом. Внесение в пита-

тельную среду MgSO

·7H

О и KH

в массовых

концентрациях 0,25 г/дм

и 0,16 г/дм

соответс-

твенно оказывало стимулирующий эффект на син-

тез лимонной кислоты.

Выделение РНК

. Использованная в работе мето-

дика выделения РНК является модификацией

одноэтапной техники Хомчинского и Сакки [1, 2]

применительно к исследуемому биообъекту — грибу

A. niger

[3]. Тотальную РНК выделяли из мицелия

гриба, культивированного в условиях, способству-

ющих синтезу лимонной кислоты, в течение 3, 4 и

5 сут. В качестве лизирующего реагента использо-

вался TRIzolв (Invitrogen, США) или аналогичный

ему ExtractRNA (Евроген, РФ) и т. п. В качестве

ингибитора РНКаз для предохранения препарата

РНК от деградации использовался реагент RNasin

(DIALAT, РФ).

Контроль качества выделенной РНК проводили

с помощью электрофореза в 15%-ном агарозном

геле. Количественные характеристики препаратов

РНК оценивались спектрофотометрическими мето-

дами.

Результаты и обсуждение

Выделение РНК

. Ранее

в исследовании ферментов гриба

A. niger

разруше-

ние клеточной стенки и мембраны проводили при

помощи ультразвукового воздействия. Однако этот

метод оказался не пригоден для анализа генетичес-

кого материала, в частности матричной РНК в силу

ее чрезвычайно высокой лабильности [2]. Это пот-

ребовало разработки нового метода получения нук-

леиновых кислот из мицелия

А niger.

Навеску замороженного мицелия, хранившего-

ся при температуре не выше –70 °С, переносили в

стерильную охлажденную жидким азотом ступку.

УДК 577.21

Методы получения и анализа РНК

из промышленного штамма

гриба

Aspergillus niger

Д-р техн. наук, профессор Т. А. Никифорова; Т. В. Выборнова

Всероссийский научно-исследовательский институт пищевых добавок, г. Санкт-Петербург

Аспирант К. В. Алексеев; д-р биол. наук, профессор В.П. Комов

Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия

Биотехнологические и микробиологические аспекты

Электронная Научная СельскоХозяйственная Библиотека