ЭлБиб

Аграрная наука Евро-Северо-Востока, № 4 (47), 2015 г.

щихся у ячменя, возможно, обусловливает

адаптацию растений к различным условиям

окружающей среды [4].

Фотопериодическая чувствительность

(ФПЧ) ячменя контролируется двумя гена-

ми: на длинном дне – геном

Ppd-H1

, распо-

ложенном на хромосоме 2Н, на коротком дне

– геном

Ppd-H2

(хромосома 1Н) [5]. Доми-

нантный аллель

Ppd-H1

определяет чувстви-

тельность растений ячменя к длинному фо-

топериоду и тем самым индуцирует раннее

зацветание в условиях длинного дня. За-

держка перехода к фазе колошения на длин-

ном дне связана с наличием рецессивного

аллеля (

ppd-H1

) [6].

Подразделение генотипов ячменя на

озимые и яровые объясняется эпистатиче-

ским взаимодействием локусов

Vrn-H1

Vrn-H2

[7]. В доминантном локусе

Vrn-H2

присутствуют три гена (

ZCCT

-Ha,

ZCCT

-Hb

ZCCT

-Hc) [8]. Один из них кодирует бел-

ковый фактор, который делает невозможным

экспрессию гена

Vrn-H1

. Сочетание доми-

нантного аллеля в локусе

Vrn-H2

и рецес-

сивного аллеля в локусе

vrn-H1

приводит к

озимому типу развития. Для сортов ячменя с

доминантным аллелем

Vrn-H2

характерно

более позднее колошение [9].

Возможность идентифицировать ал-

лельные варианты локуса

Vrn-H2

является

важной с точки зрения селекции, так как

позволяет прогнозировать длину вегетаци-

онного периода ячменя и быстро опреде-

лять в лабораторных условиях аллели это-

го локуса у гибридов между озимыми и

яровыми сортами [10].

Цель исследований

– выявление алле-

лей гена

Ppd-H1

Vrn-H2

у сортов ячменя

селекции ВНИИЗК имени И.Г. Калиненко.

Материал и методы.

Для молекуляр-

но-генетического анализа аллелей гена

Ppd-Н1

геномную ДНК выделяли из пророст-

ков ячменя по стандартной методике c ис-

пользованием СТАB-буфера [11]. Маркирова-

ние аллелей генов

Ppd-Н1

Vrn-H2

осуществ-

ляли с помощью ПЦР с использованием ал-

лель-специфичных праймеров и рестрикцион-

ного анализа [6, 8, 10, 12].

ПЦР проводили в термоциклере (Gene-

Amp PCR system 9700). При выявлении алле-

лей гена

Ppd-H1

в состав реакционной смеси

объемом 20 мкл входили: 50-100 нг ДНК,

1 × буфер для Taq полимеразы (pH 8,6, 2,5 mM

Mg2+) (Sileks), 200 мкмоль dNTPs, 0,25 мкмоль

каждого праймера и 2,5 ед. Taq полимеразы

(Dialat). Рестрикционный анализ проводили в

общем объеме 15 мкл, содержащем 3 мкл

продукта ПЦР, 1 × SEBuffer B (pH 7,6), 7,5 ед.

активности эндонуклеазы

Msp I

Для выявления аллелей

Vrn-H2

в со-

став реакционной смеси для ПЦР объемом

20 мкл входили: 50-100 нг ДНК, 1 × буфер

для Taq полимеразы (pH 8,6, 2,5 mM Mg2+)

(Sileks), 250 мкмоль dNTPs, 0,125 мкмоль

каждого праймера и 2,5 ед. Taq полимеразы

(Dialat).

Визуализацию продуктов ПЦР прово-

дили с помощью электрофореза в 1,3% ага-

розном геле в 0,5 × ТВЕ буфере (напряжение

100-120 V, 1,0-1,5 ч) с добавлением броми-

стого этидия.

Результаты и их обсуждение.

Из-

вестно, что в случае яровых сортов, из-за

делеции всех трех генов ZCCT в локусе

vrn-

(рецессивный аллель), ген

Vrn-H1

эффек-

тивно экспрессируется, что позволяет расте-

нию быстро перейти к колошению. Для сор-

тов-двуручек также показано наличие рецес-

сивного аллеля в локусе

vrn-H2

[8].

Для выявления аллелей

Vrn-H2

нами

использовался протокол мультиплексной

ПЦР, разработанный Zitzewitz et al. (2005) [8].

Мультиплексную ПЦР проводили с двумя

парами праймеров (табл. 1). В случае доми-

нантного аллеля синтезируется продукт раз-

мером 1513 пн, тогда как при наличии рецес-

сивного аллеля этот ПЦР-продукт отсутству-

ет, однако амплифицируется фрагмент гена

Snf2P

[13], который также располагается на

хромосоме 4H и присутствует как у яровых,

так и озимых генотипов. Наличие ПЦР-

продукта гена

Snf2P

(375 пн) подтверждает

успешную ПЦР и свидетельствует о присут-

ствии рецессивного аллеля

vrn-H2

Амплификация ПЦР-продукта Snf2P

(375 пн) у сортов Ратник, Мастер и Грис сви-

детельствует о присутствии у них рецессивно-

го аллеля

vrn-H2

и подтверждает их принад-

лежность к ячменям двуручкам (рис. 1)

В результате проведения ПЦР у сортов

Грис и Мастер был амплифицирован фраг-

мент последовательности гена размером

620 п.н. (рис. 2 а), содержащий функцио-

Электронная Научная СельскоХозяйственная Библиотека