NED364051NED

255 гидролизом ее 11 эндонуклеазами и сравнение полученных паттернов с референтными штаммами. Этот прием позволяет различать почти все изолируемые культуры на уровне вида, но не подвида [4]. К недостаткам данных способов можно отнести необходимость проведения гидролиза и секвенирование ампликонов, сравнение каждо­ го с базой данных GenBank и в результате - длительность процесса тес­ тирования и высокую стоимость. Целью наших исследований было разработать способ маркирова­ ния нуклеотидных последовательностей при помощи специфических синтетических олипонуклеотидных праймеров в П Ц Р с использованием в качестве молекулярной мишени ДНК генов, характерных соответ­ ственно только для Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, для Streptococcus thermophilus и для Lactobacillus acidophilus. М А Т Е Р И А Л Ы И М Е Т О Д Ы И С С Л Е Д О В А Н И Я Исследованию были подвергнуты культуры, выделенные в разные годы в лаборатории микробиологии ГЕНУ СибНИИС Россельхозакаде- мии (г. Барнаул). Для выделения ДНК использовали модифицированный нами фенольный метод депротеинизации ДНК из суспензии штаммов и культур, выращенных на средах Бликфельдта и MRS. Определение нуклеотидных последовательностей генов, харак­ терных соответственно только для Lactobacillus delbrueckii subsp. bulga­ ricus, для Streptococcus thermophilus и для Lactobacillus acidophilus, про­ водили методом выравнивания, а для анализа праймеров по уровню свободной энергии использовали программу OLIGO 4.0. Химический синтез праймеров осуществляли амидофосфитным методом на автома­ тическом синтезаторе ASM-102U (Biosset Ltd, Новосибирск). Постановку П Ц Р проводили на амплификаторах "Бис" М-105. О ре­ зультатах судили по размеру синтезированного фрагмента ДНК, мигри­ рующего в 1,0%-ном геле агарозы при силе тока 35-40 мА. В качестве маркера использовали ДНК pBLSKII(+), гидролизованную Mspl. Полу­ ченные результаты документировали с помощью цифровой фотокаме- ры. Результат П Ц Р считали положительным, если продукт реакции со­ ответствовал ожидаемому размеру фрагмента ДНК. Секвенирование ампликонов выполнили по двум цепочкам ДНК, ис­ пользуя общепринятые методики Т. Маниатис, Э . Фрич, Д. Сэмбрук [5] и Максама-Гилберта [6]. Р Е З У Л Ь Т А Т Ы И С С Л Е Д О В А Н И Й И О Б С У Ж Д Е Н И Е Выбор генов, характерных для соответствующих штаммов, прово­ дили на основе анализа полных геномов референтных штаммов Lacto­ bacillus delbrueckii subsp. bulgaricus : A T C C 1 1842, A T C C BAA-365, ND02 и 2038; Streptococcus thermophilus: LMG18311, CNRZ1066 и LMD9 и Lactobacillus acidophilus NCFM, представленных в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ GenBank Search.html). По результатам поис­ ка были выбраны и синтезированы олигонукпеотидные праймеры для Lbul4F и Lbul5R , S ttIF и Stt2R, L a d d l F и Ladd2R. Концентрацию спе-