NED360717NED

Выбор оптимальной температуры отжига зависит от уровня гомо­ логии между праймерами и сиквенсом тестируемого образца и устанав­ ливается эмпирическим путем. При использовании 10-мерных прайме­ ров в качестве матрицы для дизайна 11-мерных производных подходя­ щей может быть температура отжига в пределах от 45 до 54 °С. На рисунке 1 представлены результаты амплификации образцов геномной ДНК люцерны с экспериментальными праймерами при раз­ ных температурных условиях ПЦР. 1 2 3 4 5 6 7 8 Рис. 1. Продукты амплификации геномной ДНК люцерны с праймером OPR-16 и его производными 1 — молекулярный маркер (100 bp DNA Ladder); 2, 3 — ПЦР-продукты с 10-мерным праймером (5'CTCTGCGCGT) при Сотжига 37 и 50 °С, соответственно; 4-8 ПЦР-продукты с 11-мерными праймерами: 4 - (5'CTCTGCGCGTА + 5'СТСTGCGCGTG) при С = 50 °С; 5 - (5’CTCTGCGCGTG + 5'CTCTGCGCGTT) при 1° = 52 °С; 6 - с праймером 5'CTCTGCGCGTA при t° = 50 °С; 7 - (5'CTCTGCGCGTA + 5'С1С 1GCGCG1C) при t° = 48 °С; 8 - (5'CTCTGCGCGTA + 5'CTCTGCGCGTG) при t° = 50 °С Электрофореграмма наглядно иллюстрирует, что при низко­ специфичных условиях ПЦР с 10-нуклеотидным праймером получаем несколько неспецифичных полос амплификации (лунка 2). ПЦР- продукты с 11-мерными праймерами, амплифицированные при более жестких условиях, показаны полосками в лунках 4-8. Мы успешно применяли эту технику для анализа маркеров наследования в сегреги­ рующей популяции люцерны. Полученные спектры были достаточно интенсивны, амплифицировались только определенные фрагменты (рис. 26). Применение модифицированного способа позволяло получить бо­ лее информативную картину амплификации и повышало воспроизводи­ мость RAPD-маркеров без повторных экспериментов, упрощая анализ с большим объемом данных. 183