NED360717NED

плификации. Доминантная природа RAPD-маркеров не позволяет отли­ чить гомозиготу от гетерозиготы, а это снижает ценность информации, особенно при картировании генома. Одной из основных проблем RAPD-анализа является недостаточный уровень воспроизводимости по­ лученных результатов, что может быть обусловлено низкой температу­ рой отжига праймеров и разными источниками производства фермента полимеразы и буферов, используемых в смеси для полимеразной цеп­ ной реакции, а также особенностями оборудования для ее проведения. В связи с этим, цель наших исследований заключалась в изучении возможности повышения надежности RAPD-маркеров при использова­ нии их в геномном анализе люцерны и клевера лугового. Материалы и методы исследований. Геномную ДНК для экспериментов выделяли из свежей листовой ткани растений тетраплоидной люцерны и клевера лугового экспресс- методом [14]. ПНР выполнялась на термоциклере «BioRad» (USA) при начальной температуре денатурации 94°С в течение 9 минут и поел е- дующих 40 циклах с режимом амплификации: 92°С — 45 секунд; 48 °С (50 или 52°С) — 30 секунд; 72°С — 1 минута и 40 секунд; 72С — 5 минут. В качестве праймеров использовали OPR-16 (Орегоп Technologies Inc. USA) и комбинации с ним, полученные путем присое­ динения дополнительного нуклеотида (А, Т, G или С) к З'-концу. После электрофореза на 1,8%-ном агарозном геле ПЦР-продукт визуализиро­ вали под ультрафиолетовым освещением. Результаты и обсуждение. Мы попытались повысить надежность RAPD-маркеров путем ис­ пользования новых праймеров, отличающихся от исходного дополни­ тельным нуклеотидом. На основе 10-мерного праймера OPR-16 (5'- CTCTGCGCGT), который генерировал несколько отчетливых RAPD- маркеров на люцерне и использовался как матрица, были разработаны 4 производных 11-мерных праймеров. В экспериментах был использо­ ван принцип избирательной амплификации ДНК-фрагментов с помо­ щью серии праймеров, различающихся только конечным нуклеотидом, и широко применяющийся для анализа различий в экспрессии генов, в РНК-фингерпринтинге и др. [15]. Такой подход обеспечивает повы­ шение специфичности ПЦР, а значит, воспроизводимости и надежности генерируемых RAPD-маркеров. В нашей работе экспериментальные ре­ акции провели со следующими модификациями: вместо одиночного праймера использовали комбинации из двух прай­ меров с дополнительным нуклеотидом у 3’-конца; применяли более жесткую температуру отжига праймеров, что повыша­ ло специфичность реакции и давало возможность получить только ста­ бильные ПЦР-продукты. 182