ЭлБиб

ции сортов, маркирования генов хозяйст

венно ценных признаков, а в некоторых

случаях и для различения отдельных ге

нотипов.

Наиболее широкое применение среди

методов ДНК-маркирования, нашли осно

ванные на полимеразной цепной реакции.

В ходе ПЦР многократно увеличивается

количество копий целевых последова

тельностей. Технология предусматривает

применение особых последовательностей

нуклеотидов - праймеров, фланкирую

щих амплифицируемую последователь

ность ДНК. Среди них можно выделить

RAPD, ISSR, RFLP, SSR и др.

Методы ДНК-паспортизации вне

дрены в селекцию и семеноводство. Так,

в России применяют идентификацию

сортов сои [5], косточковых культур

(сливы, алычи, вишни и черешни) [6] на

основе микросателлитных (SSR) марке

ров, клевера лугового на основе RAPD-

маркеров [5] и др. Для люпина в России

ранее не был разработан метод ДНК пас

портизации.

Цель данной работы заключалась в

выявлении генетического полиморфизма

между сортами люпина трех видов: бело

го

(L. albus),

желтого

(L. luteus)

и узколи

стного

(L. angustifolius)

методами ДНК-

маркирования.

Геном этой культуры изучен еще не

достаточно, поэтому для достижения це

ли необходимо было выбрать метод, ос

нованный на анализе анонимных после

довательностей ДНК. Так можно эффек

тивно оценивать вариабельность большо

го количества локусов, распределенных

по всему геному. Одним из наиболее эф

фективных, малозатратных и быстрых

является метод ISSR-PCR.

Основой ISSR-метода, или анализа

полиморфизма

межмикросателлитных

участков ДНК, является ПЦР с одним или

несколькими праймерами длиной в 15-24

нуклеотида, которые состоят из тандем

ных коротких 2-4 нуклеотидных повторов

и одного-двух селективных (якорных)

нуклеотидов на 3’-конце праймера [7].

Продукты амплификации представляют

собой фрагменты ДНК с неизвестной по

следовательностью длиной от 100 до

3000 п.н., находящиеся между инверти

рованными, близко расположенными

микросателлитами. В ходе ISSR-PCR

обычно амплифицируется 25-50 продук

тов реакции. Количество образующихся

фрагментов может отрицательно корре

лировать с количеством нуклеотидов в

единице повтора [8]. Метод хорошо вос

производим в строгих условиях реакции.

Главное преимущество этого метода за

ключается в том, что он не требует дли

тельного и дорогостоящего шага конст

руирования геномных библиотек.

Несмотря на то, что ISSR-маркеры по

большей

части

наследуются

как

доминантные и являются маркерами

случайного типа, они очень часто

используются для различных целей

молекулярно-генетического

анализа

благодаря тому, что позволяют проводить

исследования быстро и не требуют

больших затрат.

Полиморфизм оценивают по присут

ствию или отсутствию фрагментов ДНК в

спектрах электрофореграмм (рис. 1, 2),

что определяется различиями в последо

вательностях ДНК сайтов связывания

праймеров.

В работе использовали образцы лю

пина узколистного: 39 сортов россий

ской, польской, белорусской и австра

лийской селекции, 6 гибридных, 5 диких

форм и 7 образцов биологического банка

генов из Белоруссии; 6 сортов люпина

желтого и 17 сортообразцов люпина бе

лого.

Полимеразную цепную реакцию про

водили в четырехканальном ДНК-ампли-

фикаторе «Терцик» («ДНК-технология»,

Москва). Использовали ферменты и реак

тивы НПО «СибЭнзим» (Новосибирск).

Реакционная смесь объемом 20 мкл со

держала следующие компоненты: 1 ед.

Taq-полимеразы Е338, 2 мкл 10-кратного

SE-буфера AS, 3 ммоль MgCb, 0,2 ммоль

каждого dNTP, 10 пмоль каждого из

праймеров, 20 нг геномной ДНК и НгО.

Научная электронная библиотека ЦНСХБ