38 / 204
клеток РК-15. Культивирование клеток, заражение их вакцин
ным штаммом вируса КЧС ЛК — ВНИИВВиМ осуществляли
согласно “Методическим указаниям по иммунофлуоресцент-
ной диагностике классической чумы свиней”. Выделение РНК
вируса из зараженных клеток РК-15 и патологического мате
риала проводили, используя одноступенчатый (смесь гуани
дина — фенола — хлороформа) метод.
На начальном этапе работы были выбраны последова
тельности олигонуклеотидных праймеров (затравок) для про
ведения реакций обратной транскрипции и амплификации.
Затравки должны удовлетворять следующим условиям —обла
дать специфичностью и выявлять в ПЦР возможно большее
число нуклеотидных последовательностей вируса классичес
кой чумы свиней разных штаммов. Несмотря на то, что при
сравнении друг другом различные штаммы вируса обнаружи
вают значительную гетерогенность, были выбраны наиболее
гомологичные участки генома вируса для синтеза комплемен
тарных олигонуклеотидных праймеров, применение которых в
методе РТ—ПЦР позволило бы выявить все изоляты вируса
КЧС.
Верхний праймер 5* — CTG GCC TGG GTG ACT ACG
—
У
использовали для синтеза первой цепи ДНК, комплемен
тарной вирусной РНК классической чумы свиней, в реакции
обратной транскрипции, а нижний праймер — 5’АТА ACT САА
TGG AAC CTG — 3’ в ДНК — полимеразной реакции для
синтеза второй цепи к ДНК. Затем оба праймера использовали
для амплификации участка генома вируса в полимеразной цеп
ной реакции.
Для визуализации продуктов реакций РТ—ПЦР прово
дили электрофорез их в 1% агарозе. Маркер молекулярной массы
состоял из продуктов расщепления ДНК плазмиды pUC18 ре
стрикционной эндонуклеазой Alul. Анализ считали положи
тельным, если продукт ПЦР соответствовал ожидаемому-раз
меру фрагмента в 379 нуклеотидные пары.
Было проведено тестирование вируса в пробах патологи
ческого материала, доставленных от свиней различных свино
комплексов Сибири (Тюменской, Новосибирской областей и
Красноярского края) с клинической картиной классической
чумы свиней. Практически во всех анализируемых пробах было
обнаружено наличие вируса чумы свиней. Результаты вирусо-
выделения на культуре клеток показали полное соответствие с
данными, полученными в ПЦР.
Результаты, проведенных экспериментов показали, что
36
Научная электронная библиотека ЦНСХБ