NED373392NED

124 Труды Федерального центра охраны здоровья животных. Том X аппарате УВМТ-12–250. Культивирование проводили при тем- пературе 37 о С и скорости перемешивания 200 об/мин в течение 8 ч. Средняя концентрация микробных клеток в суспензии при OD 620 составляла 0,7. Для освобождения от бактериальных клеток пробы бульон- ных культур центрифугировали при 8000 g в течение 20 мин при температуре 4–6 о С. Дополнительно проводили стерилизующую фильтрацию супернатанта через мембранный фильтр с диамет- ром пор 0,22 мкм. Осаждение экзотоксинов из культурального фильтрата (КФ) проводили с помощью сульфата аммония. Для освобождения белковых концентратов от соли использовали диа- лиз против фосфатного буферного раствора в течение ночи. В полученных токсинсодержащих суспензиях определяли концен- трацию общего белка по Бредфорду, титр гемолизина ApхI с ис- пользованием эритроцитов барана, титр гемолизина ApхII с ис- пользованием эритроцитов кролика, количество гемолитических единиц (ГЕ/мл), а также титр цитотоксина ApхIII (log 2 ЦТД 50 ) на первичной культуре клеток АМС. Определение гемолитической активности штаммов A. pleuropneumoniae. Определение гемолитической активности культуральных фильтратов и концентратов проводили двумя способами: – на агаровых средах с добавлением 5 % дефибринирован- ной крови барана и/или кролика. Для этого в лунки вносили аликвоты КФ и инкубировали при 37 о С в течение 18 ч, учиты- вая затем диаметр зоны β-гемолиза; – в суспензии с внесением 1 % взвеси отмытых эритроци- тов. Для этого дефибринированную кровь барана и/или кролика центрифугировали в течение 10 мин при 1000 g. Полученные в осадке эритроциты три раза отмывали барбиталовым буферным раствором с рН 7,2, содержащим 0,032 % желатина, 3,9 mМ барбитала натрия, 1,0 mM MgSO 4 , 0,38 mM CaCl 2 и 145,6 mM NaCl. Осадок эритроцитов ресуспендировали в стократном объ- еме буферного раствора. Полученная 1 % суспензия эритроци- тов соответствовала концентрации 7,0±0,5×10 7 клеток/см 3 . Для определения 100 % гемолиза – к 1 мл 1 % взвеси эрит- роцитов добавляли 3 мл дистиллированной воды. Пробирки ин- кубировали при температуре 37°С в течение 45 мин, охлаждали Электронная Научная СельскоХозяйственная Библиотека