ЭлБиб

На сегодняшний день существует несколько методов для

конструирования рекомбинантных аденовирусов и все они осно

ваны на гомологичной рекомбинации [8]. В основе первого ме

тода лежит гомологичная рекомбинация между перекрывающи

мися фрагментами вирусной ДНК в эукариотических клетках. Но

этот процесс трудоемкий и дает низкий выход рекомбинантной

вирусной ДНК. Второй метод, описанный Graham F. и соавтора

ми [6], основан на гомологичной рекомбинации между двумя

плазмидами в эукариотических клетках: одна из которых содер

жит полноразмерный вирусный геном, а другая несет желатель

ную модификацию (вставку, делецию и т. д.), фланкируемая по

следовательностями гомологичных областей вирусного генома.

Третий метод, описанный Chartier и соавторами [2], основан на

гомологичной рекомбинации в Escherichia coli. Последние два

метода имеют лучший результат по сравнению с первым, но ам

плификация плазмид несущих полный вирусный геном часто

дает низкий выход рекомбинантной вирусной ДНК.

В настоящее время разработан способ конструирования ре

комбинантных аденовирусов птиц CELO с использованием кос-

мидной технологии [5], который позволяет получить рекомби

нантную вирусную ДЦК достаточно легко. В основе этого метода

лежит способность космидного вектора упаковывать молекулу

рекомбинантой ДНК, находящейся между двумя cos-сайтами в

головке бактериофага Л с образованием инфекционных фаговых

частиц in vitro. При этом для успешной упаковки ДНК, ее длина

должна быть больше 38 т.п.н., и меньше, чем 52 т.п.н. Процесс

инфицирования фаговыми частицами клеток E.coli более эф

фективен, чем трансфекция плазмидной ДНК. Попав в клетку,

рекомбинантная ДНК амплифицируется и сохраняется в ней в

виде плазмиды.

Для получения космиды CosA1/CELO (46,7 т.п.н.) в космид-

ный вектор SuperCosAI (4,4 т.п.н.) мы клонировали геном аде

новируса птиц CELO с делецией в правом плече генома в сайте

EcoRV (42,3 т.п.н.) путем лигирования in vitro. Затем продукт ли

гирования был упакован в головки бактериофага А, которые

вмещают молекулы ДНК, фланкируемые двумя cos сайтами. За

тем были инфицированы клетки Е. coli головками бактериофа

га А. В результате инфекции было получено большое количество

ампицилин .. устойчивых

клонов,

несущих

плазмиду

pCosA1/CELO.

Электронная Научная СельскоХозяйственная Библиотека