17 / 222
ВОПРОСЫ ЭКОЛОГИИ ВОЛЖСКО-ОКСКОГО МЕЖДУРЕЧЬЯ
стекле с 0,6 мкл забуференного физраствора (ЗФР). Половина объе
ма разведенной гемолимфы помещалась в 0,3 мкл ЗФР на другом
предметном стекле. Оба стекла центрифугируются в изолирующих
влажных камерах при 30 g 3 минуты с последующим осторожным
отмыванием мазков в ЗФР. Далее на мазки наносится 2% суспензия
инактивированых и отмытых в ЗФР дрожжевых клеток. Один ма
зок инкубируется 30 минут, а другой— 2 минуты для выявления
высокоактивных фагоцитов, так как максимум адгезии фагоцитар
ного материала к таким клеткам наступает уже через 2...5 минут.
После промывания в ЗФР на мазках ставится тест с тетразолием
нитросиним (НСТ) (концентрация раствора - -3 мг/мл, время инку
бации - 30 минут). Затем мазки фиксируются в 2,5% р-ре забуфе-
ренного глутараральдегида 20 минут и окрашиваются метиловым
зеленым-пиронином.
Данная методика позволяет выявить максимальные потенци
альные возможности гемоцитов. Для выявления текущей актив
ности гемоцитов проводился НСТ-тест без предварительного цен
трифугирования клеток и нагрузки дрожжами.
При микроскопитровании по каждой клетке выявлялся индекс
активности (ИА) - количество адгезированных дрожжевых кле
ток к гемоциту (адгезивно-фагоцитарная активность) и НСТ-балл
по 4-х балльной системе (определяется по количеству и плотности
гранул восстановленного до диформазана НСТ на поверхности
мембраны гемоцита) - киллинговая активность.
Данные заносились в бланк иммунограммы по каждому мазку
отдельно.
По трех- и шестидневным личинкам вычислялся общий индекс
активности (ОИА) - суммарная адгезивно-фагоцитарная актив
ность определенного подтипа гемоцитов в 1 мкл гемолимфы при
максимальной антигенной нагрузке и суммарный индекс активнос
ти (СИА) - для всех фагоцитозположительных гемоцитов:
ОИА
= N • п
отвп/тгем • ИА п/тгем отв
СИА =
N потв.гем. *
ИА
отв.гем
где
N -
удельное содержание гемоцитов в 1 мкл гемолимфы; nотвп/г гем'
ИАотвп/тгсм - удельное содержание и индекс активности фагоци-
16
Научная электронная библиотека ЦНСХБ