NED379019NED

6 результате переноса гена. Выявлена эффективность этой конструкции в защите растения, в частности от солевого стресса [3]. Целью работы явилось создание трансгенных растений- регенерантов люцерны изменчивой с геном Fe-СОД. Материалы и методы исследований. Объектом исследований служил образец люцерны изменчивой МН2. Семена люцерны скарифицировали механическим путем с помо- щью наждачной бумаги, поверхностно стерилизовали 70%-ным спир- том в течение трех минут, затем диацидом в течение 5 мин., отмывали стерильной дистиллированной водой три раза и помещали на поверх- ность агаризованной среды Гамборга В 5 без фитогормонов. Для генетической трансформации использовали эпикотили 7–8– дневных проростков [4] и ночную культуру Agrobacterium tumefaciens . Генетическая конструкция создана А. А. Гулевичем [3]. Инокулирован- ные эпикотили культивировали на агаризованной питательной среде В 5 Гамборга до появления ореола бактерии вокруг эксплантов, которые за- тем отмывали в стерильной дистиллированной воде, подсушивали на фильтровальной бумаге и помещали на питательную агаризованную среду В 5 Гамборга с 0,5 мг/л бензиламинопурина (БАП) для индукции морфогенеза. Морфогенные культуры и растения-регенеранты отбирали на питательной среде Гамборга с добавлением селективного фактора канамицина в концентрации 50 мг/л (маркерный ген в конструкции npt11 ). Для элиминации агробактерии в среду добавляли антибиотик клафоран в начальной концентрации 500 мг/л. Полученные в процессе культивирования растения-регенеранты с хорошо развитой корневой системой высаживали в вегетационные со- суды с почвой в теплицу. Геномную ДНК для ПЦР анализа выделяли из молодых листьев зеленых растений, выращенных в условиях теплицы, с помощью набора реагентов «ДНК-Эстран-4» производства фирмы «Синтол», по инструк- ции изготовителя. Кусочки листовой ткани (до 30 мг) предварительно промораживали в течение суток в морозильной камере при температуре –20 ºС. Для амплификации использовали два специфических праймера FeS1 и FeS2 [3]. Амплификационная смесь содержала 1 мкл ДНК (10– 100 нг); 1 мкл Tag-DNA полимеразы (5000 ед./мл); 4 мкл 10 × ПЦР - буфер с MgCl 2 ; 1,5 мкл смеси dNTPs (2,5 мМ каждого нуклеотида), 0,5 мкл каждого праймера (0,25 мМ) и 13 мкл деионизированной воды в общем реакционном объеме 20 мкл. Реактивы получены от НПО «Си- бЭнзим». ПЦР проводили по стандартной методике на термоциклере «BIO- RAD» (США) при температуре отжига 60 ºС. Режим амплификации