NED379019NED

13 Для исследований также использовали гибриды, полученные от скрещивания райграса и овсяницы: фестулолиум № 6 (райграс много- цветковый × овсяница тростниковая); фестулолиум № 49 (райграс мно- гоцветковый × овсяница луговая) и фестулолиум В -90 (райграс много- цветковый × райграс пастбищный). Работа проводилась на основе оптимизированных методов моле- кулярно-генетического анализа. Для выделения геномной ДНК из рас- тений козлятника восточного использовали семена, которые проращи- вали в чашках Петри по 120 штук от каждого сортообразца. Из навески (60 мг) средней части корешков шестидневных проростков осуществля- ли ДНК-экстракцию методом Эдвардса [11] с последующей очисткой смесью хлороформа и изоамилового спирта (24 : 1). Для получения ДНК из образцов злаковых культур использовали листовую ткань растений, выращенных в полевых условиях. ДНК выде- ляли после предварительной проморозки (в течение суток при – 20 ºС) листовой ткани (30 мг) каждого растения с помощью коммерческого набора реагентов DNeasy Plant Mini Kit (QIGEN Group). Образцы геномной ДНК изучаемых культур анализировали с ис- пользованием праймеров произвольного сиквенса от «Operon Technolo- gies Inc.» (США), синтезированных фирмой «Syntol». Смесь для поли- меразной цепной реакции готовили с реактивами фирм «Syntol» и «Helikon» (Россия). ПЦР-продукты получали в результате выполнения программы из трех этапов с чередованием температурных и временных параметров в программируемом термоциклере «AMPLY 4L» («Biokom», Россия). Ос- новной этап состоял из 37 циклов реакции с температурой отжига прай- меров + 36ºС. Полученные фрагменты амплификации разделяли с п о- мощью электрофореза в 1,4%-ном агарозном геле и визуализировали под ультрафиолетовым светом после прокрашивания в 0,5 мг/мл рас- творе бромистого этидия. Результаты и обсуждение. При подборе праймеров для иденти- фикации анализируемых сортообразцов и гибридов мы остановились на тех, которые оказались достаточно информативными в наших преды- дущих исследованиях при изучении полиморфизма клевера лугового. В общей сложности было использовано 10 праймеров произвольного сик- венса, из них 9 — для анализа сортообразцов козлятника восточного (табл. 1). Результаты анализа показали, что на козлятнике восточном шесть праймеров из девяти протестированных генерировали продукты ампли- фикации различной степени интенсивности. Это праймеры OPN-15, OPB–07, OPB-15, OPB-11, OPB-17, OPC-02. Размер продуктов ПЦР варьировал от 300 до 1100 нуклеотидных пар (рис. 1).