1-248.indd

179 Биотехнология выживаемость ФЭК: выбор оптимального, нетоксичного соотноше- ния криопротекторов и сыворотки КРС, добавляемых к клеточной суспензии для замораживания; изучение уровня жизнеспособности клеток ФЭК в зависимости от продолжительности хранения при сверхнизких температурах (минус 150 °С); изучение выживаемости клеток ФЭК при криоконсервировании и хранении в жидком азоте (минус 196 °С); исследование клеток ФЭК, подвергавшихся крио- консервированию, на восприимчивость к вирусам. Материалы и методы Получение и культивирование первично трипсинизированных клеток ФЭК. Первично трипсинизированные клетки ФЭК получали по общепринятой методике [2]. В работе использовали 12-суточные эмбрионы SPF-кур-несушек (фирма «Lohman Tierzucht», Герма- ния). После изготовления суспензии отбирали образцы, добавляли в них краситель Trypan Blue Stain 0,4% (Invitrogen, США), проводи- ли подсчёт живых (неокрашенных) клеток с использованием авто- матического устройства Countess (Invitrogen, США). Для получения монослоя КК ФЭК применяли культуральные флаконы площадью 125 см 2 (SPL Life Science, Корея). Концентрацию клеток доводи- ли ростовой средой до 800-950 тыс. кл/см 3 при объёме вносимой суспензии в культуральный флакон 100 см 3 . В качестве ростовой среды применяли смесь сред Лейбовица (Sigma, США) и Маккоя (Sigma, США) в соотношении 2:1. Данная смесь содержала 10% фе- тальной сыворотки КРС (Bioclot, Бразилия). Инкубировали первич- ную культуру при 37 °С в течение 24 ч. После образования монослоя проводили диспергирование клеток следующим образом: из флако- нов сливали ростовую среду, добавляли по 20 см 3 смеси трипсина и версена (ФГБУ «ВНИИЗЖ») в соотношении 1:20, инкубировали при комнатной температуре до полной дезагрегации монослоя. По- лученную суспензию сливали в центрифужные пробирки и осаж- дали в течение 10 мин при 800 об/мин. Осадок ресуспендировали в бессывороточной среде в объёме 100 см 3 для каждого образца. В отобранных образцах подсчитывали количество живых клеток, после чего рассчитывали коэффициент выживаемости на первом пассаже: H = C/D, Электронная Научная СельскоХозяйственн я Библиотека