1-248.indd

122 Болезни птиц «СИНКО-ИФА». Титр антител в испытуемых пробах определяли по конечной точке титрования. Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией в реаль- ном времени ( ОТ-ПЦР-РВ). Проводили на приборе «Rotor-Gene 6000» («Corbett Research», Австралия) с использованием ферментов AMV Reverse Transcriptase и Go Taq ® Flexi DNA Polymerase («Promega», США), праймеров и ДНК-зонда для выявления МПВ птиц подтипа А. Количественный анализ субпопуляций лимфоцитов. Выделение лимфоцитов из периферической крови и лимфоидных органов кур проводили по стандартной методике с использованием Ficoll-Paque tm PLUS (Amersham Biosciences, Швеция). Подготовку проб для выяв- ления поверхностных маркеров лимфоцитов осуществляли с исполь- зованием меченых моноклональных антител CD45-FITC, CD4-PE, CD8α-PE, CD3-PE (Southern Biotech, США), CDBu1a-PE (Serotec, Ан- глия). Количественный анализ клеток проводили на проточном цитоф- луориметре BD FACS Calibur (Becton, Dickinson, США). Измерение и обработку полученных результатов осуществляли с использованием программного обеспечения Cell Quest Pro 1.0. Определение продукции интерферона гамма. Суспензию лимфо- цитов селезёнки в концентрации 1×10 7 клеток/мл активировали конка- валином А (ConА) (Sigma-Aldrich, США) (0,1 мг/мл) и инкубировали в CO 2 -инкубаторе при температуре 37 °С в течение 48 ч. В качестве отрицательного контроля использовали лимфоциты, инкубирован- ные со средой RPMI 1650. Продукция интерферона гамма (IFN-γ) была оценена в ИФА с использованием набора Chicken IFN-γ CytoSet (Biosource, США). Гистологическое исследование. Кусочки органов размером 0,5×0,5×0,5 см фиксировали 4% раствором формалина в 80% растворе этилового спирта в течение 48 ч и заключали в парафин. С парафи- новых блоков получали срезы толщиной 5-7 мкм (микротом Microm HM340E, Германия). Готовые препараты окрашивали гематоксилином и эозином для обзорной окраски. Микроскопическое исследование препаратов производили на инвертированном конфокальном микро- скопе Nikon Eclipse Ti-E C2+ (Япония). Статистический анализ результатов. Для статистической обра- ботки данных использовали программу Statistica 10.0 (Stat Soft. Inc., США). Существенность различий результатов цитофлуориметриче- Электронная Научная СельскоХозяйственная Библиотека