1-248.indd

110 Болезни птиц Реакция торможения гемагглютинации (РТГА). Реакцию про- водили в соответствии с рекомендациями Всемирной организации здравоохранения животных по диагностике гриппа птиц (МЭБ, 2015). Выделение суммарной РНК . Cуммарную РНК выделяли из 10- 20% суспензий внутренних органов, а также смывов с помощью на- бора для выделения РНК RNeasy Mini Kit (Qiagen, кат. № 74106) со- гласно инструкции производителя. Обратно-транскриптазная полимеразная цепная реакция в ре- жиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ) . Реакцию проводили в про- граммируемом амплификаторе Rotor-Gene TM 6000 (Corbett Research) или Rotor-Gene Q (Qiagen) набором OneStep RT-PCR Kit (Qiagen, кат. № 210212). Собирали реакционную смесь объемом 25 мкл: 9 мкл воды, свободной от РНК-аз, 5 мкл 5×буфера для ПЦР, 1,25 мкл 25 мM MgCl 2 (Promega, кат. № M8296), 1 мкл 10 мM dNTP, по 1 мкл 10 мкМ соответствующих праймеров, 0,75 мкл флуоресцентного зонда, 1 мкл смеси ферментов, содержащей ревертазу и полимеразу, 5 мкл раствора суммарной РНК. Инкубировали 30 мин при 50 °С. Собственно амплификацию проводили при следующих температур- ных режимах: 10 мин при 95 °С и последующие 45 циклов реакции, состоящие из денатурации ДНК в течение 10 с при 95 °С, отжига праймеров – 35 с при 55 °С, элонгации кДНК – 10 с при 72 °С. Ре- зультаты амплификации оценивали по окончании реакции, анализи- руя амплификационные кривые. Выделение вируса гриппа птиц в развивающихся куриных эмбрио- нах проводили в соответствии с рекомендациями МЭБ по диагно- стике гриппа птиц (МЭБ, 2015). Реакция торможения нейраминидазной активности (РИНА). Ре- акцию проводили согласно утвержденным методическим рекомен- дациям [3]. Результаты и обсуждение Исследовали 544 пробы сыворотки крови от 20 видов диких и синантропных птиц на наличие антител к вирусу гриппа птиц под- типов Н5, Н7 и Н9 в реакции торможения гемагглютинации. Резуль- таты представлены в табл. 1. Электронная Научная СельскоХозяйственная Библиотека