NED373393NED

53 Болезни сельскохозяйственных животных отидов при получении не менее чем четырех независимых последователь- ностей для каждого фрагмента. Такая схема позволила надежно определить полную последовательность генома изолята Pi/Rus/Kemerovo/762-2/05, кроме участков длиной около 20 н. на 3’- и 5’-конце последовательности, соответствующих внешним праймерам. Использованные в работе олигонуклеотиды (праймеры) были синтези- рованы научно-производственной фирмой ЗАО «Синтол» (Россия). Выделение вируса. Выделение вируса проводилось согласно руководст- ву МЭБ (O.I.E. Manual of standards for diagnostic tests and vaccines, 2011) в 9-11-сут. эмбрионах СПФ-кур. Выделение РНК. РНК выделяли с помощью коммерческого набо- ра для выделения РНК/ДНК РИБО-сорб-100 разработки ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора (Россия), согласно инструкции производителя. Набор предназначен для выделения нуклеиновой кислоты в исследуемых образ- цах путем сорбирования РНК/ДНК на силикогеле. Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Секвенирование. ОТ-ПЦР проводили в одну стадию с использованием на- бора Qiagen OneStep RT-PCR Kit, 25 мМ раствора хлорида магния (Promega, США) и соответствующих олигонуклеотидных праймеров для амплифика- ции необходимых фрагментов генома ВНБ в программируемом амплифи- каторе MiniCycler (MJ Reseаrch Inc, США) или Терцик (ДНК-технология, Россия). Общий объем реакционной смеси на одну реакцию составлял 25 мм 3 . В пробирку объемом 0,5 см 3 вносили 5 мм 3 раствора кДНК и 20 мм 3 реакционной смеси, содержащей по 1 мм 3 10 мкМ прямого и обратно- го праймеров, 1 мм 3 10 мM dNTP, 5 мм 3 5х буфера для ОТ-ПЦР, 1,25 мм 3 25 мM MgCI 2 , 1 мм 3 смеси ревертазы и полимеразы (Enzyme mix), 9,75 мм 3 деионизованной воды до конечного объема, сверху наслаивали 25 мм 3 ми- нерального масла. Амплификацию проводили при следующем режиме: 50ºС – 30 мин, 95ºС – 5 мин, (95ºС – 0,5 мин, 52ºС – 0,5 мин, 72ºС – 1 мин) 40 циклов. Анализ полученных в ОТ-ПЦР фрагментов ДНК проводили методом электрофореза в 2% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. Результаты электрофоретической реакции визуализировали с использова- нием трансиллюминатора. Очистка продуктов ОТ-ПЦР и нуклеотидное секвенирование. Специфичные фрагменты ДНК вырезали из агарозного геля и очищали с использованием набора Wizard ® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, США) согласно инструкциям производителя. Очищенные продукты ОТ- ПЦР секвенировали с теми же праймерами (использованными для ампли- Электронная Научная СельскоХозяйственная Библиотека