NED373393NED

36 Болезни сельскохозяйственных животных дили коммерческим набором для выделения ДНК с сорбентом Нуклеос+ (БиоКом, г. Москва) согласно инструкции производителя. Для выявления аденовируса с помощью ПЦР использовались праймеры и зонды, специфи- ческие для генетических групп С и D. Реакционная смесь для амплификации включала в себя: 5 мкл 5-кратно- го ПЦР-буфера, 2,5 мкл 25 мМ MgCl 2 , 1 мкл водного раствора 10 мМ dNTP, 0,25 мкл Taq-ДНК полимеразы 5 ед/мкл, по 10 пмоль прямого и обратного праймеров, 5 пмоль ДНК-зонда, 5 мкл раствора суммарной ДНК и воду до конечного объема 25 мкл. Температурный режим реакции состоял из сле- дующих этапов: 95  С – 20 с, 58  С – 35 с и 72  С – 20 с. Количество циклов – 40. Реакцию проводили с использованием системы для проведения ПЦР в режиме реального времени «Rotor-Gene 6000» («Corbett Research»). FAdV D2 FAdV C Праймер Последовательность Праймер Последовательность FAdVD2-9F CAG-ATG-ACA-ACT- CCC-TAC-GAA-AA FAdVC-433F CCC-TAC-TGC-GGC- ACG-GCT FAdVD2- 224R CGT-CGT-TCT-TGA- GCG-GTT-TA FAdVC-608R CCT-GGT-TGG-GAT- TGG-GGA-AGA FAdVD2- FAM AT-CGT-CGC-CGC-TCT- TTC-AGG-GGT-T FAdVC- FAM-562 ACC-TCC-AAA-GAC- ACG-ACG-GCG-G Учет результатов реакции происходил на каждом цикле. Прибор опре- делял уровень флуоресценции и строил кинетическую кривую в координа- тах: уровень флуоресценции – цикл амплификации. В случае присутствия в исследуемой пробе специфической матрицы, кинетическая кривая имела экспоненциальную зависимость. Программа определяла пороговый цикл реакции (Ct – threshold cycle), на котором превышалась фоновая флуорес- ценция, и результат считался положительным. Непрямой жидкофазный блокирующий вариант иммуноферментного анализа (Б-ИФА) . К двукратным разведениям исследуемых и контрольных проб добавляли равный объём блокирующих антител (сыворотки крови морской свинки и кролика к FAdV-2 и FAdV-4, соответственно) в рабочем разведении. Смесь инкубировали в течение 1 ч при температуре 37°С, за- тем вносили по 100 мкл смеси в лунки полистиролового планшета (Nunc, MaxiSorp, Дания), предварительно сенсибилизированного соответствую- щим антигеном аденовируса птиц (FAdV-2 или FAdV-4), и далее проводили реакцию непрямого ИФА. В лунки, являющиеся контролем фона, добавля- ли 100 мкл буфера для разведений. Все компоненты в реакции добавляли Электронная Научная СельскоХозяйственная Библиотека