NED373393NED

127 Вопросы биотехнологии Сбор материала проводили спустя 48–72 ч при поражении клеток не менее 80%. Сосуды с вирусом замораживали при температуре –20°С и раз- мораживали при температуре 20–25°С. Вируссодержащий материал сте- рильно собирали в 5–10-литровые бутыли. Отбирали пробу (1–2 см 3 ) для определения титра вируса. Титрование реовируса проводили с использованием суспензии клеток Vero и ФЭК и 96-луночных культуральных планшетов с плоским дном в СО 2 -инкубаторе при температуре 37±0,5°С. 10-кратные разведения вируса от 10 –1 до 10 –8 делали в отдельной сте- рильной посуде на питательной среде, используемой для культивирования клеток с содержанием 2% сыворотки. Затем переносили в культуральные планшеты по 100 мкл на лунку с культурой клеток. На каждое разведение использовали не менее четырех лунок. Планшеты слегка встряхивали и оставляли при температуре 37±0,5°С на 1 ч для сорбции вируса клетка- ми. Реакцию сопровождали контроли: контроль культуры клеток – лунки с культурой клеток этой же партии, в которую вносили поддерживающую среду без вируса; контроль вируса – лунки с культурой клеток этой же пар- тии, в которую вносили нативный вирус. После этого планшеты помещали в СО 2 -инкубатор (СО 2 5%). После 3-7-сут. инкубации при температуре 37±0,5°С оценку наличия вируса проводили по характерным вирусиндуцированным изменениям клеточной морфологии. Результаты учитывали через 6-7 сут. по появлению характерных цитопатических изменений в зараженной культуре клеток при отсутствии таковых в контроле. Титр вируса рассчитывали по методу Кербера в модификации Ашмарина и выражали в lg ТЦД 50 /см 3 [4]. Заражение развивающихся куриных эмбрионов (сроком инкубации 10 сут.) вируссодержащим материалом проводили в аллантоисную по- лость в объеме 0,2 см 3 с биологической активностью вируса не ниже 6,0 lg ТЦД 50 /см 3 . Зараженные куриные эмбрионы инкубировали 72 ч при тем- пературе 37,5±5,0°С и относительной влажности 60–70% в вертикальном положении пугой вверх, проводя ежедневную овоскопию. Эмбрионы, по- гибшие в период 48–120 ч и оставшиеся в живых, охлаждали в течение ночи. После чего от них отбирали хорионаллантоисные оболочки и экс- траэмбриональную жидкость. Для определения биологической активности полученного материала были приготовлены серийные 10-кратные разведе- ния (10-1–10-8), которые инокулировали в развивающиеся куриные СПФ- эмбрионы. Для каждого разведения использовали по 4 куриных эмбриона. Электронная Научная СельскоХозяйственная Библиотека